Способ определения фоксима в секционном материале Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

:о

СГд

Изобретение относится к химическому анализу секционного материала для обнаружения в нем фосфороргацического инсектицида фоксима 0, этилтиофосфорил 0-(альфа-цианобензальдоксим при судебно-медицинской экспертизе острых отравлений. Цель изобретения - повьшение чувствительности способа. Способ осуществляется следующим образом. Для изолирования фоксима к 25 г средней пробы измельченного органа (печень, почки, желудок,, кишечник ) в колбе вместимостью 200-250 мл с притертой пробкой добавляют 50 мл н-гексана, 25 г безводного сульфата натрия и оставляют на I2 ч при периодическом перемешивании. Жидкость отфильтровывают в колбу отгонки расрастворителя. Остаток в колбе внойь заливают 50 мл н-гексанаи извлекают при периодическом взбалтываний в те чение 2 Ч. Извлечение отфильтровы, вают и присоединяют к основному. Операцию повторяют. Растворитель отгоняют на ротационном вакуумном испарителе при 25-30С до объема 10-12 мл, С целью отделения основной массы балластных веществ производят экстра ционную и хроматографическую очисткУи делительную воронку КЧ вместимостью 75-100 мл с помощью н-гексан переносят сконцентрированное до 10-20 мл извлечение из биологическо го материала так, чтобы объем гекса новой фазы составил 25 мл, В делитель ную воронку наливают 25 мл диметил- формамида (ДМФА), насыщенного н-гек саном, и экстрагируют при энергично взбалтьшании 3 мин. Нижнюю фазу ДОФ переносят в делительную воронку К вместимостью 75-100 мл, содержащую 25 мл н-гексана, насьщ енного ДМФА, В делительную воронку добавляют 25 мл ДМФА, насьпценного н-гексаном. Содержимое делительных воронор №1 и З взбалтывают 3 мин. После разделения слоев из делительной воронки №2 ДМФА переносят в делительную воронку №3 .вместимостью 500 мл, содержащую 40 мл 12%-ного раствора хлорида натрия, а из делительной воронки №1 в делительную воронку №2, В делител ную воронку №1 добавляют 25 мл ДМФА 72 насыщенного н-гексаном. Содержимое воронок №1 и 2 взбалтывают 3 мин. Слой ДМФА из воронки переносят в воронку №3, а из воронки №1 - в воронку №2, Гексановую фазу в воронке №1, содержащую экстрактивные вещества, отбрасывают. Взбалтывают содержимое делительной воронки № 3 3 мин, по разделении слоев ДМФА извлечение отделяют и присоединяют к экстракуту в воронке №3, Гексановую фазу в воронке №2, содержащую экстрактивные вещества,отбрасывают,Содержимое воронки №3 осторожно перемешивают, ; при этом отделяется слой н-гексана, Добавляют 10 мл н-гексана и реэкстрактируют фоксим взбалтыванием в течение 3 мин. После разделения слоев нижнюю водную фазу отделяют в колбу вместимостью 50 МП, Гексановую фазу переносят в делительную воронку №4 вместимостью 75-100 мл, содержащую 50 мл 12%-ного раствора хлорида натрия, Раствор из колбы переносят в дели-. тельную воронку №3, стенки промьшают 10-15 мл 12%-ногО раствора хлорида натрия и присоединяют к раствору в делительной ворон1 е №3, Водную фазу экстрагируют еще двумя порциями н-гексана по 10 мл, Гёксановые извлечения переносят в делительную воронку №4, взбалтывают с раствором хлорида натрия. Верхнюю гексановую фазу отделяют и переносят в колбу вместимостью 50 мл с г безводного сульфата натрия,Делительную воронку.№4 промывают 5-8 мл и н-гексана, присоединяют раствор к основному извлечению. Через 30 мин гексановое извлечение декантируют в колбу вместимостью 50 мл, доводят н-гексаном до метки, перемешивают, Хроматографическую очистку производят следующим образом. 25 мл полученного гексанового раствора, соответствующие 12,5 г исследуемого органа, выпаривают при комнатной температуре до объема 0,5-1 мл, С помощью стеклянного капилляра, используя для смыва бензол, раствор переносят в виде полосы длиной 6,5-7 см на стартовую линию хроматографической пластинки с закрепленным слоем кремневой кис- лоты Стеклянные пластины :см изготавливают способом поливки по прописи из расчета на 1 кремне3

вой водой кислоты (150 меш) 0,026 г, гипса (150 меш ) 0,0013 г, дистиллированной воды 0,06 мл. Пластинки сушат при комнатной температуре 12 ч. При перегрузке сорбента, что иногда наблюдается при исследовании объектов с большим содержанием жира, для препаративной хроматографической очистки используют меньшую аликвоту исследуемого раствора, например соответствующую 6-8 г органов.

На стартовую линию той же пластин- ки на расстоянии не менее 2 см от края пластинки и 2,5-3 см от края . полосы исследуемого извлечения наносят в виде пятна диаметром -2 мм раствор фоксима в бензоле (метчик) в количестве 10-12 мкг в пятно. Через 10 мин хроматографируют в систе ме бензол. Фронт растворителя 14-14,5 см, время хроматографирования 30-40 мин. При этом фоксим (Rf 0,47-0,60) отделяется от экстрак тивных веществ (Rf 0,70-0,95). Оргаг нический растворитель удаляют при комнатной температуре 15-20 мин. Часть хроматограммы, соответствующую полосе исследуемого раствора, защищают стеклянной пластинкой, а открытую часть с метчиком опрыскивают палладиевым реактивом. Через 15-20 мин обнаруживается пятно мет-, чика.

Из защищенной части пластинки, соответствующей расположению метчика делают соскоб сорбента в виде прямоугольной полосы шириной 4 см ( по 2 см в обе стороны от центра проявленного метчика ). Соскоб переносят в стеклянную хроматографическую колонку (внутренний диаметр 1,5 см), на дно которой предварительно помещают небольшой тампон ваты, и элюи- руют 50 мл смеси н-гексана - ацетон 1:1, добавляя порциями по 5-8 мл и обмывая стенки колонки. Элюат коли чественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл с помощью н-,гек- сана и объем раствора доводят до метки тем же растворителем. Аликвотыраствора исследуют.

Хроматографическое исследование проводят последовательно в двух системах 1. на пластинках силикагеля КСК ,в системе бензол при проявлении хромогенными реактивами на различные функциональные группы фоксима (реак

6772

циями, описанными ниже в пунктах а или б, в и г ) при сравнении Rf исследуемого вещества с Rf фоксимаметчика (внешний стандарт); исследование в системе бензол может быть проведено и на пластинках Силуфол в сочетании с хромогенными пробами, описанными в пунктах а (или б )и в; П. на пластинках Силуфол, им10 прегнированньгх 60%-ным раствором ДМФА в метаноле в системе н-гексан, насьш енным даФА, Обнаружение фокси- на осуществляют пaллaдиeвы i реактивом (пункт в ). Разделение. проводят

15 при использовании внутреннего метчика-фоксима.

При исследовании реакциями с палладиевым, бромфеноловым синим, 4-НБП реактивами и пробой на органи-,

20 чески связанный фосфор, возможно проявление пятен экстрактивных веществ, но они отличаются от фоксима по величине Rf.

Хроматографическое исследование

25 проводят следующим образом.

. Аликвоты элюата, эквивалент- ные 2 г органов (для обнаружения палладиевым и. 4-НБП реактивами ) и 2,5 г органов (для реакции обнаруже30 иия по фосфору и с бромфеноловым синим реактивом ), наносят после предварительного удаления избытка растворителя на стартовую линию хроматографических пластинок с тонким

а- слоем силикагеля КСК (стеклянные пластинки 13x18 см изготавливают спо-. собом поливки по прописи из расчета на 1 силикагеля КСК (150 меш) 0,013 г, гипса (150 меш ) 0,0007 г,

Q дистиллированной воды 0,03 мл; пластинки активируют при в течение 1ч в виде пятен диаметром 0,3-0,5 см. Для перенесений остатков используют бензол. Растворы наносят

..на пластинку с помощью стеклянных капилляров. На расстоянии не менее 2 см исследуемых пятен наносят пятно метчика (раствор фоксима в бензоле 3-5 мкг в пятно ). Хроматограмму развивают в системе бензол. Фронт

50 растворителя 14-14,5 см. Растворитель удаляют при комнатной температуре в течение не менее 30 мин и проводят реакции обнаружения Rf - фоксима 0,45-0,60.

а. Обнаружение палладиевым раствором: Хроматограмму опрыскивают реактивом (водный раствор 5%-ного содержащий 5 мл хлорида палладия, концентрированной соляной кислоты в 100 мл раствора, перед употреблением реактив разбавляют этанолом 1:12 ), Пятна желто-коричневого, коричневого или бурого цвета (в зависимости от количества фоксима ) проявляются через 15-20 мин, при относительно больших количествах вещества, а при близких к границе в течение 24 ч. б.Обнаружение бромфениловым синим реактивом: хроматограмму опрыскивают бромфениловым синим реактивом (смесь 2%-ного раствора нитрата серебра в воде и 0,4%-ного раствора бромфенилового синего в ацетоне 1: f,. нагревают при 50 G 10 мин ). По охлаждении опрыскивают 5%-ным раствором уксусной кислоты. Появляются пятна синего цвета на желтом фоне. , в.Обнаружение 4-НБП 4- п-нитро бензил )пиридин : пластинку опрыскивают до увлажнения 2%-ным ацетоновым раствором 4-НБП, затем, избегая сильного увлажнения, 20%-ным раство ром карбоната аммония разбавленным ацетоном 1:1, нагревают в сушильном шкафу при 20°С 10 мин, охлаждают, опрыскивают 10%-ным раствором гидроксида натрия в 50%-ном этаноле На белом фоне появляются фиолетовосиние пятна, постепенно обесцвечива щиеся. Сразу же отмечают проявленные зоны. г.Обнаружение по фосфору: хрома тограмму (в камере для опрыскивания под тягой )опрыскивают, избегая пол ного увлажнения, раствором хлорной и соляной кислот в присутствии моли дената аммония реактив №1 для обнару жения по фосфору: к 1%-ному раствору молибдата аммония в 0,1 М раство ре соляной кислоты добавляют 5% хлорной кислоты 57% и нагревают при 230-250°С в течение 60 мин (под тягой ) в супшльном шкафу. По охлаждении пластинку опрыскивают реактивом №2 5 г молибдата натрия (Na2MoO - ) растворяют в 150 мл 2 н. соляйой кислоты и смешивают с 1г малахитового зеденого в 100 мл 2и. соляной кислоты; через 1-2 ч ф.ильтруют через бумажный фильтр, храйят в темной склянке). Через 5-10 мин отмечают пятна зеленого цвета на оранжевом фоне. 72 6 В описанной хроматографической системе аналогично фоксиму проявляется и имеет такое же значение величи.ны Rf байтекс, близкие значения Rf дифос, трихлорметафос-3,трихлорметафос. Для исключения их проводят дополнительную реакцию обнаружения с 4- аминоантипирином. На хроматографическую пластинку наносят аликвоту элюата, эквивалентную 2, г органа, а также пятно метчиков - байтекса и других фосфорорганических пестицидов (ФОП ) (3-5 мкг в пятно ) и хроматографируют в той же системе. Пластинку опрыскивают 6%-ным раствором гидроксида натрия, нагревают при 120с в сушильном шкафу 30 мин. По охлаждении опрыскивают 1%-ным раствором 4-аминоантш1ирина гидрохлорида, затем 1,4%-ным раствором феррицианида калия. В присутствии байтекса, дифоса, трихлорметафоса -3 и трихлорметафоса образуются пятна розового цвета. При использовании пластинок Силуфол на стартовую линию наносят аликвоты элюата, эквивалентные 0,5 г органа, метчик - раствор фоксима в бензоле (l-2 мкг в пятно ). Фронт растворителя 10 см. Обнаружение фоксима проводят палладиевым (или бромфеноловым синим ) и 4-НБП реактивами, обнаружение байтекса, дифоса, трихлорметафоса-3 и трихлорметафоса - реакцией с 4 аминоантипирйном. Rf-фоксима 0,40-0,63. II. Для подтверждения обнаружения фоксима и для дифференциации фоксима от байтекса, а также от других ФОП (при их обнаружении )проводят исследование на пластинках Силуфол, импрегнированных 60%-ным раствором даФА в метаноле, используя в качестве подвижной фазы н-гексан, насьш енньй ДМФА. В связи с тем, что в данной хроматографической системе при исследовании может наблюдаться разброс в значениях Rf, особенно в присутствии следов экстрактивных веществ, используют внутренний стандарт (метчик )- фоксим. Оценку результатов анализ по величинам Rf производят на основании сравнения Rf-исследуемой пробы, в которую введен внутренний метчик - фоксим, и исследуемой пробы, к которой внутренний метчик не был добавлен.

7.

На пластинки Силуфол на расстоянии не менее 2,5 см от края и 2,5 см одна от другой наносят в виде пятен диаметром не более 0,5 см аликвоты исследуемых извлечений, эквивалентHbie 0,5 г органа. Приведенные аликвоты элюата являются оптимальными для граничных и приграничных концентраций фоксима - 230-400 мкг в 25 г органа, при больших концентрациях наносят меньшие аликвоты раствора. При этом из элюата каждого органа исследуют две аликвоты, к одной из них добавляют внутренний стандарт фоксим (в количестве 5-10 мкг в ис-, следуемую аликвоту), к другой не добавляют, Фоксим-метчик добавляют в виде раствора в н-гексане или ацетоне непосредственно к отобранной аликвоте элюата, перемешиваюТ| органический растворитель удаляют до 0,2-0,5 мл и остаток наносят в виде пятна на пластинку (Силуфол 20x20 ). При обнаружении байтекса или других ФОП их также вводят в анализируемую пробу в качестве внутренних метчиков ( мкг препарата в пятно ), Расстояние наносимых пятен от края хроматографической пластинки должно быть не менее 3 см, расстояние между пятнами не менее 2 см.

После нанесения на пластинку исследуемых проб и по удалении растворителя (5-10 мин) пластинку погружают в раствор ДМФА в метаноле так, чтобы ее поверхность была смочена до уровня на 0,5 см выше нанесенных на стартовую линию исследуемых растворов. Влажную часть пластинки осушивают, прикладывая лист фильтровальной бумаги. Область пластинки с пятнами и ниже стартевой линии опрыскивают из пульвери- . затора до легкого увлажнения раствЬром даФА в метаноле. Пластинку оставляют на 10-12 мин под тягой, затем помещают в хроматографическую камеру, содержащую н-гексан, насыщенный ДМФА, Предварительное насыщение камеры парами растворителя осуществляют в течение 1-1,5 ч. Перед внесением каждой новой хро967728

матографической пластинки камеру насьщают парами растворителя не Ь1енее 40.ыин. Фронт растворителя 12-14 см. Органический растворитель удаляют под тягой в течение ,1,5-2 ч.После этого пластинку ис- следуют реакциями, описанными в пунктах айв, Rf фоксима 0,58-0,73, Определяют и сравнивают

10 величины Rf проявленных зон пятен исследуемых извлечений (без внесенных метчиков-стандартов и с внесенными внутренними метчиками При одновременном присутствии фoкcи

fj ма и других исследованных ФОП наблюдается четкое отделение их от фоксина. Экстрактивные вещества (Rf О; 0,90-1,0 ) также отделяются от фоксима, . Пример, Исследуют три пробы

2Q почек из трупа лица, погибшего от травматического повреждения, К полученным элюатам после хроматографи- ческой очистки, эквивалентеым 12,3 г навески, обозначенным №1 и №2, добавляют в виде раствора в ацетоне (100 мкг фоксима, в пробу №2 кроме того 200 мкг байтекса; проба №3 - контрольная (фоксим и байтекс не

. добавляли ),

JQ На пластинку Силуфол наносят в виде пятен на стартовую линию аликвоты полученных растворов (№1-3), эквивалентные 0,5 г органа. Параллельно к другим таким же апиквотам элюата проб №1-3 добавляют внутренний метчик - фоксим (5 мкг в пятно ), Исследуют на пластинках Силуфол, импрегнированных 60%-ным раствором ДМФА в метаноле, в системе н-гексан, насьщенный ДМФА. Зоны разделенных

0 веществ опытов представлены в таблице

Из таблицы следует, что в пробе №1 обнаружен только фоксим (Rf

0,72-0,74, а в пробе №2 фоксим (Rf 0,71-0,73 и байтекс (Rf 0,470,50 ). Зоны с Rf О обусловлены . экстрактивными веществами, Rf фоксима и байтекса составляет

0,23-0,24, что свидетельствует об . удовлетворительном разделении этих соединений в присутствии экстрактивных веществ тканей почек.

0,72

Не добавляли0; 0,72

50;

0,А7; 0,71

Не добавляли0; 0,47; 0,71 50;

Не добавлялиО

0,71 50;

0,7А 0,74 0,50;

0,73 0,50; 0,73

0,73

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОКСИМА В СЕКЦИОННОМ МАТЕРИАЛЕ путем извлечения его из пробы н-гексаном в присутствии безводного сульфита натрия, экстракционного перераспределения в системе н-гексан - диметилформамид с последующим хроматогра даческим анализом в тонком слое кремниевой кислоты, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, хроматографи ческий анализ осуществляют на пластинах Силуфол, импрегированных 60%-ным pacTBolDOfi диметилформамида в метаноле и н-гексане, насыщенном диметилформамидом,