Способ определения патулина в пищевых продуктах Советский патент 1984 года по МПК G01N33/02 

:о «

Э) 1 Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано при анализе тгищевых продуктов на содержание микотоксина патулина. Известен способ определения патул на в яблочном соке, предусматривающий экстракцию патулина из образца этнлацетатом, очистку экстракта на колонке с силикагелем смесью бензолзтил-ацетат (3:1), отделение патулина от примесей с помощью одномерной тонкослойной хроматографии на силика геле и обнаружение патулина по флуоресценции в длинноволновом ультрафио летовом счете после опрыскивания пластинки 3-метил-2-бензотиаз6линономНаиболее близким к предлагаемому является способ определения патулина в пищевых продуктах, предусматривающий экстракцию образца этилацетатом, очистку экстракта методом колоночной хроматографии на силикагеле, тонкослойную хроматографию в системе толуол-этилацетат-85%-ная муравьиная кислота, проявление хроматографической пластинки хлором и раствором бен зидина и обнаружение патулина в ульт рафиолетовом свете с последующим его количественным определением L2. , Недостатками известных способов являются образование трудноразделяемых эмульсий при экстракции образцов этилацетатов, вследствие чего возникает необходимость введения дополнительной стадии центрифугирования, резкое нарастание количества мешающих определению патулина примесей в исследуемых образцах сока после их разгерметизации, недостаточная очист ка экстракта на колонке от малополяр ных липидных компонентов, значительно повышающих массу пробы, наносимой на хроматографическую пластинку; недостаточное разделение патулина и других экстрагируемых веществ (мешающие примеси) в условиях одномерной тонкослойной хроматографии, часто приводящее к невозможности обнару жения и идентификации патулина, относительно высокая вероятность получения ложноположительных результатов вследствие наличия в экстрактах веществ, близких по хроматографическим ифлуоресцентным свойствам к патулину, неразделяемых в условиях одномерной тонкослойной хроматографии. Цел1 изобретения - повышение чувствительности и достоверности анализа. 462 Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения патулина в пищевых продуктах, предусматривающему экстракцию образца этилацетатом, очистку экстракта методом колоночной хроматографии на силикахеле, тонкослойную хроматографию в системе толуол-этилацетат-85%-ная муравьиная кислота, проявление хроматографической пластинки хлором и раствором бензидина и обнаружение патулина в ультрафиолетовом свете с последукщим его количественным определением, перед экстракцией этилацетатом в образец вводят 0,10,2% аскорбиновой кислоты, подвергают его диализу против 8-12.% водного раствора хлористого натрия, а перед очисткой экстракта последний сорбируют на силикагеле и очистку ведут путем последовательного элюирования толуолом и смесью гексанэтилацетита в соотнощении 2:3-2:3,5, при этом из тонкослойной хроматографии используют двумерную в системах хлороформ-ацетон-85%-ная муравьиная кислота и толуол-этилацетат-85%-ная муравьиная кислота в объемных соотношениях соответственно 78-82:14-16:4-6 и 48-52:38-42:8-12, а хроматографическую пластинку после проявления фиксируют парафином. . На чертеже представлена пластинка, на которой проводят обнаружение и индентификацию патулина. Способ осуществляется следующим образом. К исследуемому образцу добавляют аскорбиновую кислоту в количестве 0,1-0,2% и выливают в целлофановый мешочек для диализа. Закрепляют мешочек в плоскодонной конической колбе, в которую предварительно помещают 0-12% водного раствора хлористого натрия и встряхивают содержимое колбы в течение трех .часов. Затем диализный мешочек извлекают из колбы, водный раствор хлористого натрия (диализат) переносят в делительную волонку и экстрагируют этилацетатом. Этилацетатный экстракт аушат безводным сульфатом натрия, фильтруют в колбу, куда добавляют силикагель, и упаривают досуха (до консистенции пересыпаклцегося сухого порошка силикагеля) на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 С. Затем экстракт очищают 31 с помощью колоночной хроматографии. На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, наливают суспензию силикагеля в толуоле. Толуолу дают стечь, затем добавляют порцию толуола и засыпают в колонку силикагель с адсорбированным экстрактом. Колонку с нанесенным экстрактом промывают толуолом, патулин элюируют смесью гексан-этилацетата в соотношении 2:3-2:3,5. Элюат упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 С. Обнаружение и индентификацию патулина проводят с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на пластинках Силуфол, Для качественного определения пластинку размечают как показано на фиг.1а. В точку на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят определенную эликвоту упарен ного экстракта. В точки В и С на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят стандартный раствор патулина. Пластинку помещают в камеру для тонкослойной хроматографии, в которую предварительно наливают смесь хлороформ-ацетон-85%-ная муравьиная кислота в объемных отнощениях 78-82:14-16:4-6. Развитие хроматогра Ф г проводят в первом направлении до достижения фронтом растворителя карандагной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки, затем пластинку извлекают из камеры и сушат 5 мин на воздухе. Высушенную пластинку поворачивают на 90 по часовой стрелке и помещают в камеру для тонкослойной хроматографии ТСХ со второй системой растворителей толу ол-этилацетат-85%-ная муравьиная кислота в объемных соотношениях соот ветственно 48-52:38-42:8-12. Проводя развитие пластинки во вiором направлении. Затем высушенную от растворителя пластинку помещают в камеру с хлором. Атмосферу хлора в камере соз дают, смещивая растворы марганцевокислого калия и соляной кислоты. Про ветрив от остатков хлора, пластинку опрыскивают раствором гидрохлорида бензидина в муравьиной кислоте. Чере 20 мин пластинку фиксируют в парафине, т.е. опускают на 1 ев парафин, расплавленный при 40-60 С, парафину дают стечь. Пластинку рассматривают в длинноволновом ультрафиолетовом све те (лапма ОЛД-41 или прибор для флуо ресцентного анализа витаминов, мо64цель 833). Патулин проявляется в виде пятен с желтой флуоресценцией. Обнаружение на пластинке пятна патулина, соответствующего по цвету фтгуоресценции и по хроматографической подвижности пятнам стандарта патулина, свидетельствует о наличии патулина в анализируемом продукте. Для количественного определения экстракт наносят на пластинку, размеченную,как показано на фиг. 1 б В точки С, С2, С наносят разные количества стандартного раствора патулина, в точку В также наносят стандартный раствор патулина. После проведения двумерной ТСХ, проявления пластинки и обнаружения пятен патулина, сравнивая флуоресценцию разных количеств стандарта патулина с интенсивностью флуоресценции пятна патулина в экстракте, расчитывают содержание патулина в еоке или пюре по формуле V m / / , С - мкг/л (мкг/кг) где С - концентрация патулина в соке или пюре, мкг/л (мкг/кг); V - объем очищенного раствора экстракта в этилацетате перед ТСХ, мкл, Vrt - объем раствора экстракта, наносимый на пластинку, мкл; V объем сока (вес пюре), взятого для анализа, мл (г), гп - количество патулина в пятне экстракта на пластине ТСХ, иг. Пример 1. Анализ яблочного сока без мякот-и (по предлагаемому способу). I Для анализа берут 20 мл сока, добавляют 20 мг аскорбиновой кислоты, вылива.Т в целлофановый мешочек для диализа, приготовленный из листа целлофана размером 30x30 см. Закрепляют мешочек в плоскодонной конической колбе на 250 мл, в которую предварительно добавляют 200 мл 10%-ного водного раствора хлористого натрия. Колбу встряхивают в течение 4 ч на аппарате для встряхивания проб. Мешочек извлекают из колбы, водный раствор хлористого натрия переносят в делительную воронку на 500 мл, добавляют 100 мл этилацетата. Встряхивают, после разделения слоев верхний этилацетатный раствор отделяют. Нижний водньй слой экстрагируют этилацетатом (3-50 мл). Соединенные этилацетатные $1 экстракты сушат сернокислым натрием (10 г) в течение 1 ч. Сухой этилацетатный раствор фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в кру лодонную колбу на 500 мл. Сернокислый натрий промывают 25 мл свежей порции этилацетата и отфильтровывают в ту же колбу. Добавляют 1 г силикагеля и упаривают до консистенции сухого пересьшакндегося порошка силикаге ля на ротационном испарителе при тем пературе водяной бани не вьше 40 С. Для очистки экстракта с помощью колоночной хроматографии на дно стек лянной колонки помещают кусочек ваты, наливают суспензию 2 г (4 мл) в 20 мл толуола. Толуолу дают стечь затем, не допуская просыхания колонки, добавляют 20 мл толуола и высыпа ют в колонку силикагель с адсорбированным экстрактом из круглодонной колбы. Дают толуолу стечь и элюируют колонку 100 мл толуола. Толуольные элюаты отбрасывают. Круглодонную колбу споласкивают 5 мл смеси гексан -этилацетат (2:3) и вьшивают раствор в колонку, добавляют 100 мл смеси гексан-этилацетат (2:3). Элюат упаривают в грушевидной колбе на 100 мл на ротационном испарителе до объема примерно 0,2 мл при температуре не в ше . Полученный раствор анализируют с помощью двумерной тонкослойной хроматографии, т.е. определяют качественное и количественное содержание патулина. Для этого пластинку Силуфол размером 15X15 см размечают тонкими карандашными -линиями (фиг. 1 б). В точку А на расстоянии 1,5 см от краев пластинки с помощью микрошприца наносят 10 мкл из 200 мкл (0,2 мл) экстракта. В точку В наносят 3 мкл, а в точки С, €, Cj 2, А и 6 мкл стандартного раствора патулина с концентрацией 5 мкг/мл соответственно. Пластинку помещают в камеру для тонкослойной хроматографии со смесью хлороформ-ацетон-85%-ная муравьиная кислота в объемном соотношении 16:3:1. Развитие хроматограммы проводят в первом направлении до достижения фронтом раст ворителя карандашной линии. Пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе 5 мин. Высушенную пластинку поворачивают на 90° по часовой стрел ке и помещают в камеру для ТСХ со смесью толуол-этилацетат-85%-ная муравьиная кислота (5:4:1) или (50:38: 66 :12). После развития пластинки во втором направлении пластинку сушат на воздухе до полного исчезновения запаха растворителя. Для обнаружения пятен патулина пластинку помещают в камеру с хлором на 15-20 мин. Атмосферу хлора в камере создают, помешая в камеру химический стакан, в котором Смешивают 50 мл 5%-ного водного раствора марганцевокислого калия и 50 мл 25%-ной соляной кислоты. После извлечения пластинки из камеры с хлором ее оставляют в вытяжном шкафу до полного удаления хлора с пластинки. Затем пластинку опрыскивают 0,5%-ным раствором гидрохлорида бензидина в 85%-ной муравьиной кислоте. Через 20 мин пластинку опускают на 1 с в расплавленный при 57 С парафин, парафину дают стечь. После фиксации пластинку рассматривают в длинноволновом УФ-свете. На пластинке обнаруживается пятно с желтой флуоресценцией, находящееся на пересечении . перпендикуляров к направлениям развития хроматограммы, проведенных из пятен стандар-тов патулина. Сравнивая интенсивность флуоресценции разных количеств стандарта патулина с интенсивностью пят- на патулина в экстракте, определяют, что пятно экстракта соответствует 2 мкл стандартного раствора с концентрацией 5 мкг/мл т.е. 10 нг. Расчет концентрации патулина в соке: V, 10 МКГ/Л-, V2 V Таким образом, в данном яблочном соке содержится 10 мкг патулина. Пример 2. Анализ яблочного сока без мякоти (по известному способу) . 50 мл яблочного сока из той же партии, что и в примере 1, экстрагируют в делительной воронке 3 раза по 30 мл этилацетата. Объединенные этилацетатные экстракты сушат 1 ч 5 г безводного сернокислого натрия. Высушенный раствор фильтруют через химическую воронку с кусочко ваты и упаривают на ротационном испарителе до объема 2 мл. Затем экстракт наносят на хроматографическую колонку, приготовленную следующим образом: в стеклянную колонку диаметром 25 мм помещают слоями 8 г силикагеля и из него 15 г безводного сернокислого натрия. Колонку элюируют 50 мл этил7эцетата. Элюат упаривают на ротацион ном испарителе до объема примерно 1 мл. Наносят с помощью микрошприца 10 мкл полученного раствора в этилацетате на пластинку Снпуфол, на ту же пластинку наносят 2, 5 и 10 мкл стандартного раствора патулина с концентрацией 10 мкг/мл. Плас тинку помещают в камеру для тонкослойной хроматографии со смесью толуол-этилацетат-85%-ная муравьиная кислота (5:4:1). Затем пластинку изв лекают,, сушат. Пластинку обрабатывают хлором, раствором бензидина или о-дианизидина в 85%-ной муравьиной кислоте, так как это было описано в примере 1 (без фиксации пятен парафином) . Стандарты патулина проявляются в виде пятен с желтой флуоресценцией. В экстракте на уровне патулина есть слабо-желтая флуоресценция, почти н различимая из-за наложения фоновой флуоресценции неотделенных мешающих веществ. Сделать надежного заключения о наличии патулина и оценить его количество невозможно. Пример 3. Анализ яблочного пюре (по предлагаемому способу). Взвешивают 10 г пюре, разбавляют дистиллированной водой до объема 20 мл, тщательно перемешивают. Дале проводят анализ так, как описано в примере 1, только соотношение компо нентов в смеси хлороформ-ацетон-85% ная муравьиная кислота 80:15:5, а в смеси толуол-этилацетат-85%-ная муравьиная кислота 48:42:10. После проявления хроматографической пластинки бензидином обнаруживают, что интенсивность флуоресценции пятна патулина в экстракте соответствует интенсивности флуоресценции 2 мкл стандартного раствора патулина с концентрацией 5 мкг/мл, т.е. 10 нг. Расчет концентрации патулина в пюре с. f, - 2о .,.г. где V, - 200 мкл, V - 10 мкл,m - 10 нг; V - 10 г. Таким образом, в исследуемом яблочном пюре обнаружено 20 мкг/кг па тулина . Пример 4. Анализ яблока (по предлагаемому методу). Для анализа берут яблоко, пораже ное так назьгеаемой зеленой гнилью (на оболочке наблюдаются светло-ко46ричневые изменения, местами на фруктовой мякоти возникают бело-серые валики плесени). Яблоко натирают на мелкой терке, полученную массу пюре смешивают, отбирают пробу для анализа (10 г), разбавляют дистиллированной водой до объема 20 мл и анализируют,как описано в примере 1. При проведении тонкослойной хроматографии эликвоту экстракта, наносимую на хроматографическую пластинку, уменьшают до 10 мкл из 500 мкл (0,5 мл). После проявления пластинки бензидином интенсивность пятна патулина в экстракте соответствует интенсивности 4 мкл стандартного раствора патулина с концентрацией i мкг/мл, т.е. в пятне содержится 20 нг патулина. Расчет концентрации патулина в яблоке: С 122-22 ,00 мкг/кг. где V - 500 мкл V - 10 мкл; m - 20 кг; V 10 г. Анализ приведеншлх примеров показывает, что способ-прототип (пример 2) не дает возможности определить патулин на уровне 10 мкг/кг. В то же время использование аскорбиновой кислоты в качестве энтиоксиданта и ингибитора роста микрофлоры, диализ , колоночная и тонкослойная хроматография с описанными нововведениями, приводит к повышению чувствительности предлагаемого способа почти в 2 раза. При изучении хрома тографической пластинки в ультрафиолетовом свете пятно патулина, обладающее желтой флуоресценцией, четко различимо. Отсутствует наложение примесей на пятно патулина, в связи с чем не возникает затруднений в его качественном и количественном определении. Примеры 3 и 4 иллюстрируют универсальность предлагаемого способа, позволяющего определять патулин в любых видах продуктов, независимо от их консистенции. Чувствительность метода также составляет 5-10 мкг/кг. Для определения достоверности предлагаемого способа проводится анализ по предлагаемому способу и способу прототипу яблочного пюре, искусственно загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг, Соответствующем пределу обнаружения способа-прототипа и предельно допустимой концентрации 91 патулина в детском и диетическом питании, установленном в ряде зарубежных стран. Исследуемые образцы пищевых продуктов до добавления в них патулина были проанализированы на содержание патулина. Результаты показывают полное отсутствие естественного загрязнения обращов патулином. Пример 5. Анализ яблочного пюре, загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг по предлагаемому способу. К .10 пробам по 10 г каждая яблочного пюре, взятым из одной банки, добавляют патулин на уровне 20 мкг/к и Параллельно проводят анализ в соответствии с примером 3. На хроматографическую пластинку наносят 10 мкл из 400 мкл очищенного экстракта, Пос ле проявления пластинок визуально определяют количество патулина в али квоте экстракта на пластинке, сравнивая со стандартом патулина, нанесенным на ту же пластинку. В 10 параллельных пробах на пластинках обна руживают следующие количества: 3, 4, 4, 5, 5, 5, 5, 5, 6, 7 нг. Расчет концентрации патулина в образцах про водят по формуле 4-м мкг/кг. 100 мкл10 г м 3 нг, С 12 мкг/кг м 4 нг, С 16 мкг/кг; м 5 кг, С 20 мкг/кг; М 6 кг, с 24 мкг/кг; м 7 кг, С 28 мкг/кг. Таким образом, из 10 исследованных проб яблочного пюре, загрязненно го патулином на уровне 20 мкг/кг, в 5 пробах обнаружено 20 мкг/кг, в 2 16 мкг/кг, в Г- 12 мкг/кг, в 1 24 мкг/кг, в 1 - 28 мкг/кг. Пример 6. Анализ яблочного пюре, загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг по способу-прототипу. Для анализа берут 10 проб по 20 г каждая яблочного пюре из той же банки, что и в примере 5, добавляют патулин на уровне 20 мкг/кг и параллел но анализируют в соответствии с примером 2. На хроматографическую пластинку наносят 10 мкл из 1 мл очищенного экстракта. Больщую апиквоту нанести не удается из-за большой массы экстракта. После проявления пластинок в соответствии со способом-про л:отттом визуально определяют количе610ство патулина на пластинке в экстракте, сравнивая со стандартом, нанесенным на ту же пластинку. Обнаруживают, что сделать надежного заключения о наличии патулина в экстрактах и оценить его количество невозможно в 7 пробах из-за наложения пятен с желто-коричневой флуоресценцией. В 3 пробах патулин обнаружен, визуально оценено его количество на пластинке: 10, 4 и 5 нг. Из расчета концентрации патулина в пюре установлено, что при С 50 мкг/кг J м 10 нг, С - 20 мкг/кг J м 4 кг, С 25 мкг/кг, м 5 нг. Таким образом, из 10 исследованных проб яблочного пюре, загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг, патулин достоверно обнаружен в 3 пробах, из них результат завышен в 2,5 раза в одной пробе, в 1,25 раза в другой, и только в одной пробе количество обнаруженного патулина соответствует внесенному количеству. Результаты анализов яблочного.шоре, загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг, проведенных по способу прототипу и предлагаемому способу полученные в npHi iepax 5 и 6. Т а б л и ц а 1 Продолжение табл.I Относительное стандартное отклонение, % Доверительные границы для среднего значения. Примечание.н- невозможностьидентификации и количественногоопределения патулина. Статистическая обработка результат анализов показывает, что среднее значение обнаруженного количества патулина при анализе способом-прото типом занижено на 52,5% против действительного, при этом вариабельнос результатов 128%, что свидетельству ет о недостоверности способа-протот па (р Ojl). Предлагаемый способ д ет достоверные результаты (р 0,05 при вариабельности 13%. При этом среднее значение полученных результ тов отличается от действительного на 2%. Выбранный интервал аскорбиновой кислоты 0,1-0,2% является оптимальным. Добавление меньшего количества аскорбиновой кислоты влечет за собо ускоренньйрост загрязнения аналити ческой пробы продуктами, затрудняющ ми хроматографическое определение п тулина. Превышение уровня (0,2% количества аскорбиновой кислоты) не. улучшает качество анализа пищевого продукта по сравнению с выбранным интервалом (0,1-0,2%) и поэтому нецелесообразно. Кроме того, более высокие концентрации аскорбиновой кислоты (порядка 5%) при добавлении к яблочному соку приводят к полному разрушению патулина, содержащегосяв образце в количестве 300 мкг/кг на 17-й день хранения. Пример 7. Анализ образца яблочного сока, загрязненного патулином на уровне 100 мкг/кг, по предлагаемому способу с добавкой аскорбиновой кислоты на уровне 0,02%. К 20 мл яблочного сока, загрязненного патулином на уровне 100 мкг/л, добавляют 4 мг аскорбиновой кислоты. Анализ проводят аналогично примеру 1. Получают хроматогрймму, представленную на фиг. 1а, откуда видно, что флуоресцирующие в длинноволновом ультрафиолетовом свете примеси закрывают хроматографическое поле и не дают возможность обнаружить патулин в экстракте после соответствукяцего проявления. Для сравнения на фиг.16 приведена хроматограмма, полученная в результате анализа, рассмотренного в,примере 1. Использование 8-12%-ного водного раствора хлористого натрия при диализе имеет целью создание более высокого осмотического давления во внешнем диализном пространстве, что обеспечивает нужное направление процесса диализа. Использование более низких чем 8%-ных концентраций раствора хлористого натрия может приводит к разбавлению образца внутри диализного мешка и связанным с этим потерям патулина. При концентрации хлористого натрия вьше 12% происходит повьш ен- , ная диффузия воды из диализного мешочка, что приводит к заметному увеличению вязкости анализируемого образца и снижению скорости диффузии, патулина во вн-ешнее диализное пространство, снижению извлечения патулина из образца. Пример 8. Анализ нектара Свежесть, загрязненного патулином на уровне 100 мкг/кг, по предложенному способу при концентрации хлористого натрия в воде во внешнем диализном пространстве 3, 8, 10, 12 и 17%.

131

Для анализа берут 5 проб по 20 мл нектора, представлянмцего собой смесь яблочного и морковного соков с мякотью , добавляют патулин на уровне 100 мкг/л. Анализ проводят аналогияно примеру 1. Исключение составляет стадия диализа, где во внешнем диализном пространстве используют водный раствор хлористого натрия 3, 8, 10, 12, 17%, После стадии диализа замеряют объем диализата (табл. 2). На хроматографическую пластинку наносят 10 мкл из 2000 мкл. Сравнивая с различными количествами стандарта патулина, в каждом из 5 экстактов определяют 7 нг для 3%-ного раст вора хлористого натрия, 9 нг для 8%-ного, 10 нг для 10%-ного, 9 нг для 12%-ного, 8 нг для 17%-ного. Расчет концентрации патулина s образце проводят по формуле (3%) С 70 мкг/л; 10 мкл-20 мл (8%) С |200- fl2 Hr. 90 мкг/л 10 мкл.20 мл « с -f гГтfo ;;-- °° -/- н) с .;r,f52..sг.. ,3 „К./Л, -« -ГЕггй----«° - Влияние концентрации раствора хло ристого натрия во внешнем диализном пространстве на потери патулина при анализе предлагаемым способом показа но в тдбл. 2. Таблица 2 Исходная концентрация Показатели раствора хлористого натрия во внешнем диализном пространстве, % 3 1 8 I 10 I 12 Tl7 Объем раствора во йнешнем диализномпространстве до диализа, мл 200 200 200 200 200

103U6

14

Продолжение табл.2

Объем раствора во внешнем диаЛИЗном

пространстве

после диализа, мл 185 195 200 195 190

Потери патулина при ана25 10 О 10 20

зе, Из примера 8 видно, что потери патулина минимальны при предлагаемых концентрациях раствора хлористого натрия во внешнем диализном простраистве. При-мер 9. Анализ образца нектата Свежесть, загрязненного патулином на уровне 20 мкг/л, по предложенному способу за исключением соотношения растворителей дляКХ, элюирущих патулин с колонки. Для анализа берут 2 пробы по 20 мл нектара, добавляют патулин на уровне 20 мкг/л. Анализ проводят аналогично примеру 1 за исключением соотношения растворителей для элюирования патулиновой фракции с колонки: для пробы № 1 используют систему гексанэтилацетат (2:2), для пробы 2 гексан-этилацетат (2:4,5), т.е. варьируют количество этилацетата в системе относительно граничных значений. На тех пластинку наносят 0,53 мкл стандартного раствора патулином с интервалом в 0,5 мкл и 10-мкл из 400 мкл очгаценного экстракта. Пластинку проявляют и обнаруживают патулин в экстракте № 1 в количестве 5 нг на пластинке (интенсивность флуоресценции пятна пат/лина в экстракте соответсвует интенсивности флуоресценции 0,5 мкл стандартного раствора с концентрацией 10 нг/мкл), В образце № 1 обнаружено 400 иг 10 мкг/л. То мкл20 мл

т.е. только 50% внесенного патулина. Экстракт № 2 отличается большей массой после упаривания растворителя. Нанесение 10 мкл из 400 мкл затруднено, происходит пересыщение активного слоя силикагеля в точке нанесения экстракта, качество хроматографического отделения патулина от других компонентов экстракта резко снижается, пятна не имеют округлой формы и четких очертаний, размазаны по хроматографическому полю. Это делает невозможным индентификацию и количественное определение патулина в экстракте Из примера 9 видно, что при содержании этилацетата в системе ниже чем 3:2 гексана, патулин не полностью элюируется с хроматографичёской колонки, причем чем больше отклонение от предлагаемого соотношения растворителей, тем больше потери патулина, Увеличение содержания этилацетата в системе большечем 2:3,5 приводит к увеличению полярности системы и наряду с патулином элюируется большое количество прочих компонентов экстракта, значительно увеличивающих массу экстракта, что резко затрудняет проведение двумерной ТСХ. Соблюдение при КХ границ предлагаемого соотноше ния гексан-этипацетат позволяет прак тически полностью смывать с колонки патулин, оставляя на старте большую часть примесей. В системе растворителей при двумерной ТСХ изучена хроматографическая подвижность патулина и других компонентов экстракта яблочного пюре в предложенньк системах хлороформ-ацетон-85%-ная муравьиная кислота и толуол -этилацетат-85%-ная муравьиная кислот при граничных и средних значениях конце траций растворителей в с;.-темах. В табл. 3 представлена хроматогра фическая подвижность патулина в изучаемых системах растворителей. Таблица 3 Хлороформ-ацетон-85%-наямуравьиная 82:16:6 кислота Критерием оптимальности хроматографирокания вещества в тонком слое являются нахождение пятна патулина в интервале Rf между 0,35 и 0,65, а также правильная форма и четкие границы пятна, отсутствие наложения близких к патулину по флуоресцентным свойствам компонентов экстракта. Отмечено, что в системе 1 значение Rf патулина находится на верхней границе указанного интервала и дальнейшее увеличение концентрации полярных компонентов в системе приводит к превышению Rf значения 0,65 И;,следовательно,к ухудшению качества ТСХ (фиг. За). Система 4 имеет тенденцию расслаиваться, хотя значение Rf патулина удовлетворяет оптимальным условиям ТСХ. Системы 3 и 6 представляют собой граничный случай. когда дальнейшее уменьшение содержания полярных компонентов .в системе приводит к снижению Rf 0,35 и ухудшению качества ТСХ (фиг. 36). Только промежуточные соотношения компонентов (системы 2 и 5) позволяют максимально отделить пятно патулина от пятен других компонентов экстракта, пятна соединений имеют округлую форму, четко очерчены, 0,35 Rf 0,65, т.е. соблюдаются правила качественного проведения ТСХ, обеспечивающие возмож ность безошибочного обнаружения, индентификации и количественного определения патулина в экстрактах пищевых продуктов, Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность и достоверность анализа.

Ci.

Сгс,«

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТУЛИНА В ПИЩЕВЫХ niPOflYKTAX, предусматривающий экстракцию образца этилацетатом, очистку экстракта методом колоночной хроматографии на силикагеле, тонкослойную хроматографию в системе толуол-этилацетат - 85%-ная муравьиная кислота, проявление хроматографической пластинки хлором и раствором бензидина и обнаружение патулина в ультрафиолетовом свете с последующим, его количественным определением, отличающийся тем, что, с целью повьшения чувствительности. и достоверности анализа, перед экстракцией этилацетатом в образец BBQдят 0,1-0,2% аскорбиновой кислоты, подвергают его диализу против 8-12% водного раствора хлористого натрия, а перед очисткой экстракта последний сорбируют на силикагеле и очистку ведут путем последовательного злюирования толуолом и смесью гексанэтилацетата в соотношении 2:3-2:3,5, при этом из тонкослойной хроматографии g используют двумерную в системах хлороформ-ацетон-85%-ная муравьиная (Л кислота и толуол-этилацетат-85%-ная с муравьиная кислота в объемных соотношениях соответственно 78-82:14-16: :4-6 и 48-52:38-42:8-12, а хромато§ графическую пластинку после проявления фиксир.уют парафином.