СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИНЕБА В КОРМОВЫХ КОРНЕПЛОДАХ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/02 G01N33/50 

Изобретение относится к ветеринарной токсикологии, конкретно к определению остаточных количеств пестицидов в кормах, что может найти применение в практике работы ветеринарных лабораторий.

Цинеб Zn⁺⁺ этилен-1,2-бис-дитиокарбамат цинка применяется в качестве фунгицида в 0,3-0,4% -ной концентрации для обработки многих сельскохозяйственных культур (картофель, свекла, огурцы, помидоры, лук, пшеница, капуста). Обладает эмбриотоксическим, гонадотоксическим, бластомогенным, мутагенным и аллергическим действием. Цинеб относится к группе пестицидов, которые могут подвергаться нитрозированию непосредственно в почве, воде и растениях. Опасность применения цинеба заключается в том, что он и его метаболиты долго сохраняются в растениях. В ягодах смородины, обработанной 0,5% -ной суспензией цинеба из расчета 4 кг/га, остатки его через 20 дней находились в пределах 1,4-3 мг/кг (допустимые остаточные количества цинеба в растительных пищевых продуктов - 0,6 мг/кг, а в зерне - 1 мг/кг).

Существующие методы определения цинеба в различных объектах основаны на колориметрии или титриметрии продуктов гидролиза (сероуглерода или сульфата аммония), образующихся после разложения этиленбисдитиокарбамата цинка кислотами (кислотный гидролиз).

Наиболее близким техническим решением (прототипом) к заявляемому является способ колориметрического определения цинеба в продуктах питания растительного происхождения и биологических средах. Согласно этой методике анализируемую пробу весом 200-500 г измельчают и помещают в двугорлую колбу (широкогорлую колбу с боковым отростком) и приливают 100 мл 5 н раствора серной кислоты. Колбу соединяют с обратным холодильником. Отводную трубку холодильника последовательно соединяют с двумя поглотителями. Второй поглотитель соединят к аспиратору. В первый поглотитель наливают 5 мл 10% -ного раствора ацетата свинца, во второй - 5 мл 1,5% -ного спиртового раствора диэтиламина. Содержимое колбы доводят до кипения. Включают аспиратор воздух в течение 1,5 ч. Выделяющийся сероуглерод увлекается током воздуха и адсорбируется во втором поглотителе. Первый поглотитель служит для очистки сероуглерода от сероводорода и других сульфидов. Содержимое второго поглотителя количественно переносят в пробирку и приливают 0,5 мл 0,05% -ного спиртового раствора ацетата меди. При наличии сероуглерода раствор дитиокарбамата меди окрашивается в желто-бурый цвет. Через 2-3 мин после развития окраски раствор колориметрируют на фотоэлектроколориметре (ФЭК-М) с синим светофильтром в кюветах при толщине слоя 5 или 10 мм в зависимости от интенсивности окраски. Количественную оценку полученных результатов проводят по заранее построенной калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой вносят 10, 25, 50, 75, 100, 500 мкг препарата в навеску соответствующего интактного объекта и проводят определение по описанной выше методике. Чувствительность метода-прототипа: 15-20 мкг пестицида в пробе.

Недостатками указанного способа-прототипа являются:
1. Слабая чувствительность (выявляется 15-20 мкг пестицида в пробе);
2. Отсутствие специфичности (сероуглерод при кислотном гидролизе могут образовать некоторые другие пестициды);
3. Материалоемкость и сложность технологии анализа (требуются большие объемы растворителей, посуда больших объемов и т. д. );
4. Необходимость наличия малодоступного и сравнительно дорогостоящего прибора - фотоколориметра.

Целью изобретения является повышение чувствительности определения цинеба в анализируемых объектах, обеспечение специфичности анализа, сокращение времени на проведение анализа (повышение производительности труда) и исключение использования дорогостоящего прибора (фотоэлектроколориметра).

Поставленная цель достигается тем, что:
- для обеспечения специфичности и повышения эффективности экстракции цинеба из анализируемой пробы (объекта) используется хлороформ;
- применяется новая операция - тонкослойное хроматографирование для повышения чувствительности и специфичности анализа (за счет разделения компонентов и использования стандарта со строгим Rf, обеспечивающим специфичность анализа);
- для проявления пятна цинеба на хроматограмме используется специфический проявитель-реактив на основе бромфенолового синего;
- используется в качестве подвижной фазы при хроматографировании смесь двух растворителей (гексан-ацетон) в конкретном соотношении 7: 2;
- для осветления фона хроматограммы используется 0,5% -ный водный раствор марганцовокислого калия.

Заявляемое техническое решение соответствует критерию "Новизна" ибо впервые разработана новая, более совершенная технология количественного определения цинеба в кормовых корнеплодах (кормовая свекла, картофель с использованием метода тонкослойной хроматографии, позволяющая выявить цинеб в количестве 1 мкг в пробе).

"Существенными отличиями" предлагаемого технического решения являются:
1. Использование для экстракции цинеба специфического растворителя хлороформа. По способу-прототипу экстракция предусматривает кислотный гидролиз с выделением сероуглерода (который может образовываться при разложении десятков других пестицидов). В предлагаемом изобретении для экстракции использован хлороформ, поскольку цинеб хорошо растворяется именно в этом растворителе.

2. Использование хроматографического метода детектирования цинеба, который в отличие от метода-прототипа позволяет одновременно "разделить" на хроматограмме пятна сопутствующих коэкстрактивных веществ и других пестицидов (очистка) и повысить чувствительность анализа при обеспечении его строгой специфичности;
3. Исключение необходимости наличия и использования дорогостоящего прибора - фотоэлектроколориметра; использование нового проявителя - бромфенолового синего. В способе-прототипе для проявления сероуглерода использован раствор медного купороса, принцип которого заключается в том, что соли (сульфиды) меди имеют серо-бурую окраску в отличие от неокрашенных солей других металлов. В предлагаемом же способе проявитель подобран таким образом, что проявляется пятно только анализируемого соединения, а не его дериват (общий для многих карбаматов и симм-триазинов).

Перечисленные отличия (признаки) заявляемого технического решения являются существенными потому, что каждый из них отдельно взятый необходим, а все вместе взятые достаточны для того, чтобы отличить предлагаемый "Способ. . . " от всех других и характеризовать его в том качестве, которое проявляется в положительном эффекте. Иначе говоря, отсутствие хотя бы одного из вышеперечисленных признаков не дает возможности получить положительный эффект.

Положительный эффект заявляемого технического решения заключается прежде всего в повышении чувствительности анализа более, чем на порядок (определяется 1 мкг цинеба в пробе), а по способу-прототипу только 15-20 мкг. Вторым не менее важным положительным эффектом является строгая специфичность разработанного "Способа. . . ". Кроме того, предлагаемый "Способ. . . " ускоряет проведение анализа (вместо 3 ч 50 мин по прототипу требуется всего лишь 1 ч 30 мин). Положительный эффект выражается также в упрощении технологии проведения анализа за счет применения метода тонкослойной хроматографии, при этом исключается необходимость наличия дорогостоящего прибора - фотоэлектроколориметра.

П р и ме р 1. В плоскодонные колбы с притертыми пробками объемом 250 мл вносили 10 г измельченной пробы. Заражение корма в этих колбах проводили путем внесения пиридиновых растворов цинеба (стандартов) с содержанием 0,25; 0,5; 1; 2; 3 и 5 мкг препарата (всего 6 колб). После того как испарился растворитель, в колбы вносили по 20 мл хлороформа, колбы зарывали притертыми пробками и встряхивали в течение 10 мин; экстракт фильтровали, содержимое фильтра споласкивали еще 10 мл хлороформа. Хлороформенный экстракт "сушили" безводным сульфатом натрия, упаривали до 30-50 мкл и наносили на хроматографические пластинки (экстракт из каждой пробы на отдельную пластину). Экстракт на пластину наносили на нижнем левом углу, отступая 1,5 мл от левого и 2 см от нижнего краев. Затем, отступая каждый раз на 2 см от точки предыдущего нанесения, последовательно наносили стандарты с содержанием 0,5; 1; 2 и 5 мкг цинеба. После того, как высыхал растворитель, пластинку опускали в хроматографическую камеру с подвижной фазой гексан-ацетон, приготовленный в соотношении 7: 2. После поднятия фронта растворителя до метки 10 см от линии старта пластинку вынимали, высушивали при комнатной температуре и опрыскивали раствором бромфенолового синего, приготовленного следующим образом: предварительно готовили 0,5% -ный водно-ацетоновый (1 часть воды и 3 части ацетона) раствор азотнокислого серебра; затем 0,05 г бромфенолового синего растворяли в 10 мл ацетона и этот раствор в мерной колбе разбавляли предварительно приготовленным раствором азотнокислого серебра до объема 100 мл. После того, как высохла пластинка, фон отбеливали 0,5% -ным водным раствором марганцевокислого калия. В результате были получены следующие результаты. В опыте при нанесении в пробу свеклы 1 мкг вещества после проявления хроматограмм обнаружили пятно препарата коричневато-серого цвета, размером 0,5-0,6 см, имеющее округло-овальную форму. Окраска пятна устойчива в течение 3-4 дней. При внесении в пробу вещества в количестве 2-5 мкг выявлялись четкие пятна, интенсивность окраски и размер которых коррелировали с наносимой дозой цинеба. При внесении доз, превышающих 5 мкг, пятна анализируемых пестицидов становятся крупными, размытой формы, что было установлено в предварительных опытах. В опыте с заражением пробы свеклы в количестве 0,5 мкг четких результатов не получили. Из описанного примера следует, что чувствительность заявляемого "Способа. . . " определения цинеба составила 1 мкг в пробе, что в 10-15 раз чувствительнее анализа по способу-прототипу.

П р и м е р ы 2-7. Для выяснения полноты экстракции цинеба из анализируемой пробы проводились эксперименты с использованием различных растворителей, используемых для извлечения (экстракции) пестицидов.

В таблице 1 приведены результаты этих опытов.

Исходя из данных, приведенных в табл. 1, можно сделать заключение, что наилучшее извлечение цинеба из анализируемых проб происходит при экстракции его хлороформом. Другие растворители, примененные для этих целей, не дали удовлетворительных результатов.

П р и м е р 8-14. Поисковые опыты по подбору оптимальной подвижной фазы при хроматографировании проведены с использованием различных растворителей: гексан-ацетон; хлороформ-гексан; хлороформ-эфир петролейный; хлороформ-спирт (этиловый). Эти эксперименты показали, что оптимальной подвижной фазой является смесь, состоящая из гексана-ацетона. Для определения оптимального соотношения компонентов (гексан-ацетон) подвижной фазы проведено 7 серий опытов, результаты которых показаны в табл. 2.

Из данных, представленных в табл. 2, видно, что наиболее оптимальным соотношением растворителей (гексан-ацетон) в подвижной фазе, используемой для хроматографирования цинеба, является 7: 2 (Rf пестицида приближается к 0,5).

П р и м е р ы 15-18. Поиск наиболее приемлемого состава проявителя для проявления цинеба на хроматограмме проводился исходя из того, что его в целом виде можно визуализировать в виде амина, дисульфида, мочевины, этилен-бис-дитиокарбамата. Результаты экспериментов приведены в табл. 3.

Из данных табл. 3 видно, что для визуализации цинеба на хроматограмме наиболее приемлемым проявителем является реактив, приготовленный на основе бромфенолового синего, который четко проявляет стандарт в количестве 02,5-0,5 мкг.

П р и м е р ы 19-21. С целью осветления фона хроматограммы использованы растворы лимонной и уксусной кислот, а также марганцовокислого калия. В табл. 4 приводятся результаты этой серии экспериментов.

Из данных табл. 4 следует, что наиболее оптимальным реактивом для осветления фона хроматограмм после проявления цинеба бромфеноловым синим является 0,5% -ный раствор марганцовокислого калия.

П р и м е р 22. Для выяснения затрат времени на проведение анализа была проведена серия контрольных опытов по технологии прототипа и по предлагаемому способу. В результате экспериментов установлено, что на проведение анализа предлагаемым способом затрачивается 1 ч 30 мин, в то время как по способу-прототипу затрачивается 3 ч 50 мин.

Кроме того, предлагаемый способ прост в технологическом отношении и базируется на использовании доступных и дешевых реактивов, выпускаемых промышленностью. Он не требует дорогостоящего оборудования и приборов, что позволяет использовать его в условиях ветеринарных лабораторий всех уровней.

Технико-экономическая эффективность предлагаемого решения заключается: в повышении чувствительности способа определения цинеба по сравнению с прототипом в 15-20 раз (выявляется 1 мкг цинеба вместо 15-20 мкг по прототипу); в повышении специфичности (селективности) и упрощении технологии; в повышении производительности труда. Вместо 3 ч 50 мин по способу-прототипу требуется 1 ч 30 мин времени на проведение одного анализа.

Изобретение относится к ветеринарной токсикологии, в частности к определению остаточных количеств пестицидов, например цинеба, в кормовых корнеплодах. Экстракцию цинеба из измельченной пробы осуществляют хлороформом. Хроматографируют экстракт на тонкослойных пластинках типа "Силуфол" с использованием подвижной фазы из растворителей гексан: ацетон в соотношении 7: 2, проявляют бромфеноловым синим и осветляют фон хроматограмм 0,5% -ным водным раствором марганцевокислого калия. 4 табл.

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИНЕБА В КОРМОВЫХ КОРНЕПЛОДАХ, предусматривающий отбор исследуемой пробы, ее измельчение, экстракцию пестицида с последующим анализом полученного экстракта и определением количества цинеба по результатам сравнения измеренного значения показателя, коррелирующего с количеством цинеба в исследуемой пробе, с заранее заданным его значением в контрольной пробе, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, обеспечения специфичности и сокращения времени, экстракцию пестицида из измельченной пробы осуществляют хлороформом, при этом полученный экстракт анализируют путем хроматографирования на пластинках типа "силуфол" с использованием подвижной фазы растворителей гексан : ацетон в соотношении 7 : 2, причем в качестве проявителя применяют промфеноловый синий, а осветление фона хроматограмм проводят 0,5-% -ным водным раствором марганцевокислого калия.