АНТИВИРУСНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 1995 года по МПК A61K9/06 A61K31/70 

Изобретение относится к области медицины и касается способа получения применяемого наружно аккумулирующегося в коже формацевтического препарата.

Известно, что количество инфекций, вызванных вирусом лишая, несмотря на обширные врачебные воспитательные программы и новые результаты в хемотерапии, непрерывно увеличивается. Поэтому возникает постоянно увеличивающаяся потребность в антивирусных препаратах для внутреннего употребления, таких как таблетки, инъекции, растворы для вливаний и пр. (Saral, R. et al. N. Gng. I. Med. 1981, , 63-67). Наружно применяемые препараты также в увеличивающихся масштабах применяются в терапии лишайных заболеваний.

5-Замещенные, 2^'-дезоксиуредины, которые в заместители содержат также атом галогена, как (Е)-5-хлор-винил-2^'-дезоксиуридин, (Е)-5-бромвинил-2^'-дезоксиуридин и (Е)-5-иодвинил-2^'-дезоксиуридин, является очень эффективными соединениями против лишайных вирусов (De Clercq. E. und Walker, R.T. Pharm. Therapy, 1984, ,1).

Из 5-замещенных 2^'-дезоксиуридинов, которые содержат атом галогена, в качестве активного компонента вводили также 5-иод-2^'-β -дезоксиуридин (ИДУ) в многочисленные антивирусные препараты в медицинской практике, несмотря на его недостаточную химическую стабильность и токсичность его продуктов разложения (Prusoff, W.H. und Goz, B. in Sartorelli, A.C. und Jones, D.G. Antineoplustic and Immunosuppressive Agents. Part II. New Jork; Springer verlag, 1975, р.272-347).

Среди производных пиримидина для антивирусного действия были исследованы также 5-алкил-2^'-β -дезоксиуридины. При условиях in vitro эти соединения показали значительно меньшую эффективность, чем галогеновые производные (De Clerсq, E. et al. Curr. Chemother. 1978, р. 324-327).

Е. De Clercq вывел в in vitro тесте 5-замещенные 2^'-дезоксиуридины против лишайного симплекс вируса типа I (HSYI) следующим образом (Proc. of rhe 4th Int. Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Their Biological etpplications. Antwerpen, 1981): Свободно выделенные из женских эмбриоклеток фибробласт клеточной культуры был заражен вирусом лишая HSY-I. В результате изменения заражающей вирусной концентрации определяли вирусную дозу, которая вызывает цитопатогенное действие в 50% зараженной культуры (TCID₅₀). Клеточную культуру заражали таким образом, чтобы вирусная концентрация соответствовала TCID₅₀, и к этой зараженной культуре добавляли ряд концентраций отдельных 5-замещенных 2^'-дезоксиуридинов, растворенных в используемом питательном растворе (питательный раствор: минимальное количество среды Эгле (МЕМ, GIBCO) с солью Эрле, при добавлении 10% телячьей сыворотки, 101 мкг/мл пинициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, значение рН 7,4). Этот метод позволяет определить минимальную тормозящую концентрацию активного вещества, которое снижает значение TCID₅₀ вирусного штамма на логарифмическую единицу. Полученное по этому методу результаты приведены в табл.1.

Данные табл.1 показывают, что 5-изопропил-2^'-β -дезоксиуридин формулы I (ИПДУ) обладает на порядок меньшей активности против вируса лишая, чем другие 5-алкил-2^'- β-дезоксиуридины, т.е. против лишая симплекс вируса in vitro практически неэффективен. Это утверждение хорошо согласуется с установленным (Gauri K. K. Walter R.D. // Chemoterapy, 1973, , 269) фактом, что 5-изопропил-2 -дезоксиуридин в терапии против лишайного вируса не применим.

Цель изобретения приготовление фармацевтического препарата, пригодного для наружного применения, который может применяться с большей эффективностью для дерматологической обработки поражений, вызванных различными вирусами лишая.

Изобретение основано на знании того, что 5-изопропил-2^'-β -дезоксиуридин на подходящем носителе, нанесенный на кожу, аккумулируется в коже и показывает в таком виде отличные антивирусные свойства.

Табл.2 демонстрирует результаты фармакологических исследований. Эксперименты проводили с 14 С-меченым 5-изопропил-2^'-β -дезоксиуридином. Результаты показывают, что 5-изопропил-2^'- β-дезоксиуридин, нанесенный в подходящей композиции на кожу, полностью воспринимается за 15 мин, и что против ожидания 20-25% нанесенного количества активной составной части аккумулируется в коже и его концентрации в течение более 8 ч остается практически постоянной.

Изобретение основано на знании того, что аккумуляция активной составной части в коже оказалась очень селективной. Это означает, что 75-80% воспринятой дозы поступает в кровообращение и в различные органы, откуда она быстро элиминируется. В органах, которые перечислены в табл.3, концентрация 5-изопропил-2'-β -дезоксиуридина падает за 3-6 ч ниже указанной границы.

Данные табл.3 показывают, что радиоактивно меченное вещество из перечисленных органов аккумулируется в основном в коже, т.е. резорпция 5-изопропил-2^'- β-дезоксиуридина в ткани кожи селективна.

Кроме того, изобретение основывается на знании того, что 5-изопропил-2^'-β -дезоксиуридин в противоположность другим пиримидиновым нуклеозидам, медицинское применение которых известно, поразительно стабильно по отношению к таким расщепляющим нуклеозидферментам, которые расщепляют нуклеозиды при образовании основания и 2-дезоксирибозы-1-фосфата. Это было доказано как в результате ферментной реакции, так и в результате in vitro метаболизма с 14С-меченого 5-изопропил-2^'- β-дезоксиуридина.

Из мочи мышей были выделены метаболиты. Подопытные животные предварительно были обработаны 200 кг/мг 5-изопропил-2^'- β-дезоксиуридинов. 80-85% 5-изопропил-2^'-β -дезоксиуридина элиминировалось из организма нерасщепленным, в то время как 2-5% выходили из тела в виде 5-изопропилурацила и 10-15% в виде 5-(1-метил-2-гидроксиэтил)-2-дезоксиуридина.

В экспериментах было также доказано, что 5-изопропил 2^'-β -дезоксиуридин является практически нетоксичным и что он не показывает мутагенитеза или тератогенного эффекта. Даже при применении многократных количеств терапевтической дозы не появлялись поражения кожи или аллергическая реакция. На основании этих выгодных свойств 5-изопропил-2^'- β-дезоксиуридин можно применять в качестве активной составной части антивирусных, в основном, эффективных против лишайных вирусов, препаратов для дерматологических целей. Поэтому изобретение касается наружно применяемого, антивирусного фармацевтического препарата, активная составная часть которого аккумулируется в коже. Это препараты содержат 0,02-5 мас. 5-изопропил-2^'-β -дезоксиуридина вместе с носителями, разбавителями и/или другими добавками, которые применимы для получения наружно применимых фармацевтических препаратов.

Антивирусный препарат может быть получен в результате смешивания 0,02-5 мас. 5-изопропил-2^'- β-дезоксиуридина с носителями, разбавителями и/или другими добавками, которые применимы для наружно применимых фармацевтических препаратов.

Фармацевтические препараты могут применяться также как офтальмологические препараты. В этом случае они содержат 0,01-1 мас. 5-изопропил-2^'- β-дезоксиуридина в смеси с носителями, разбавителями и/или другими добавками, которые применимы для получения наружно применимых фармацевтически-офтальмологических препаратов.

Фармацевтические препараты проявляют заметную антивирусную эффективность. Они могут быть получены в виде различных готовых фармацевтических препаратов, как свечи, желе, эмульсии, суспензии, растворы, спреи, пластыри и пр. Содержание активной составной части выбирают в соответствии с обработкой или методами нанесения. Как правило, удовлетворительные результаты могут быть получены в результате нанесения 0,3-2 мас. 5-изопропил-2^'-β -дезоксиуридина на подлежащую обработке кожу.

Для получения фармацевтических препаратов в соответствии с изобретением в качестве носителей могут быть использованы ланолин, вазелин, полиэтиленгликоль, глицерин, воск, кроме того, вода и органические растворители как этанол. В зависимости от типа препарата могут быть использованы также стабилизаторы, эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, наполнители и другие добавки.

Фармацевтические препараты дополнительно к 5-изопропил-2^'-β -дезоксиуридину могут содержать также другие биологические активные вещества, например антивоспалительные (хлорамфенизол), средства, успокаивающие кожу, (азулен), средства, подсушивающие кожу (оксид цинка) и пр.

Фармацевтические препараты могут быть получены известными фармакологически-техническими способами.

5-Изопропил-2^'-β -дезоксиуридин является известным соединением и может быть получен по известному способу (Szabolcs A. Sagi I. Carbohydrates, Nuclevisides and Nucleotides , Nurleic Acids Res, 1975, 1,49-52).

Соединение обладает следующими физико-химическими свойствами: оно белое, кристаллическое, без запаха, порошкообразное со слабым горьковатым вкусом. Т_пл 181-183^оС. Растворимость при комнатной температуре: в воде (7,9 мг/см³), метаноле (25,4 мг/см³), и в этаноле (11 мг/cм³), в бензоле, хлороформе и диэтиламине оно практически нерастворимо. Оно может храниться в течение года при комнатной температуре без разложения.

Тонкослойная хроматография вещества на Si ₆₀ типа силикагельных пластин (МЕ_рк) в этилацетате (метаноле) 95:5/дала R_f значение 0,43. УФ Абсорбционный максимум был измерен при 267,4 нм. Коэффициент экстинкции составил 9500 ± 400, n 50.

Острую токсичность определяли на мышах, крысах и кроликах. Соединение вводили 14 дней внутрибрюшинно и получали следующие значения LD₅₀: Мыши 920 мг/кг Крысы 820 кг/кг Кролики 200 мг/кг
30-дневная токсичность на крысах.

Животным внутрибpюшинно вводили ежедневную дозу 5-50 мг/кг активного вещества. В течение испытательного периода (30 дней) не наблюдали разницы между обработанными и необработанными (контрольными животными). Не было различия в увеличении веса, приеме пищи, и при этом не наблюдали поражения нервной системы и не было смертельных случаев. Результаты вскрытия не показали изменений, предписываемых токсическим эффектам.

6-недельные акутные и субакутные токсикологические исследования на кроликах. Животным вводили внутрибрюшинно ежедневную дозу 3-30 мг/кг активного вещества. Во время обработки (6 недель) не наблюдали токсичных симптомов, изменения веса или случаев смерти, таких наблюдений не было и в период дополнительных двух недель наблюдений. При вскрытии не были обнаружены гистологические изменения.

Определение мутагенного и каpциногенного действия тестом Ames.

Эти исследования проводили с мутантами бактерий Salmonella typhimurium. При опытах использовали как водные растворы или суспензии с концентрациями 0,125-8,0 мас. 5-изопропил-2^'-β -дезоксиуридина, так и твердые порошкообразные формы активного вещества. Применяли диффузионно-реверсионный тест, жидкостно-реверсионный тест (Ames B. N. et al. Proc. Natl. Acud. Sci: USA. 1973, , 2281) и другие тесты фракциями (Ames B.N.et al. Mutation Res, 1975, , 347). Но не было обнаружено ни мутагенного, ни карциногенного действия.

Исследование мутагенных, тератогенных и эмбриотоксичных эффектов при in vivo условиях.

Эти исследования проводили при применении Mouse Spot Test Роуссела (Roussel L. B. Majos M.H. Genetics, 1957. , 161, Russel L.B. et al. Mutation Res, 1981, , 355) на С57/BL мышах. 5-Изопропил-2 -дезоксиуридин использовали в концентрациях 460 или 230 мг/кг в физиологическом растворе поваренной соли. При дозе 230 мг/кг, которая является 45-кратной терапевтической дозой, не смогли наблюдать ни тератогенное, ни мутагенное или эмбриотоксичное действие.

Тест на всасывание. Исследования проводили на белых CFLP мышах, мужских особях с весом 23-25 кг при применении мази, которая содержала полученный по примеру 10,8% 14С-меченого 5-изопропил-2^'- β-дезоксиуридина. Мазь применяли при дозировке 50 кг/животное. В этом эксперименте использовали 5-5 животных. Кожный покров животных подвергали депиляции с помощью депилана (продукт фирмы Hamol. International Krk, Югославия). Через 24 ч после депиляции животные фиксированно клали на спину и наносили на кожную поверхность с удаленным волосяным покровом мазь. Фиксированные животные выдерживались в течение 8 ч в камерах метаболизма, затем обработанную поверхность вытирали и фиксацию животных отменяли. Животные могли теперь до конца периода наблюдения свободно двигаться. Время наблюдения составило 15, 30, 60, 120, 180, 360 и 480 мин. Определяли оставшуюся радиоактивность в материале для стирания и воспринятую радиоактивность в различных частях тела и органах обработанных животных (кожа, кровь, печень, селезенка, почки) вместе с радиоактивностью собранной в течение 24 часов мочи. Результаты приведены в табл.4.

Как показывают данные табл.4, радиоактивность всасываемого вещества чуть изменяется за первые 15 мин. Измерение радиоактивности в коже, в крови и в других органах показало, что 20-35% активности мази всасывается, и 65-80% всасываемого количества быстро элиминируется из различных частей тела. Результаты показывают, что в теле остаются лишь следы pадиоактивного материала через 3 ч после обработки.

С другой стороны, радиоактивный материал сильно аккумулируется в коже и его концентрация через 8 ч остается практически постоянной, как показывает табл.2.

Тест-терпимость. Исследования проводили на белых мышах весом 25-30 г. В тесте были использованы животные как с неповрежденной, так и с поцарапанной кожей. За период 6 недель 2-3 см² кожи исследуемых животных обрабатывали ежедневно мазью, которая содержала 2,5 мас. 5-изопропил 2^'- β-дезоксиуридина. Контрольные группы были также обработаны мазью, которая не содержала активной составной части (плацебомазь).

После обработки животные находились под наблюдением еще 2 недели. Во время обработки и во время последующего периода наблюдения у обработанных животных не было обнаружено никаких изменений (раздражение кожи, признаки аллергии или воспаление). Гистопаталогические изменения также не были доказаны.

Клинические пробы были сделаны на свободно выбранных пациентах, которые были заражены лишаем симплекс, лишаем гениталес или лишаем Цостера. В зависимости от заболевания пациентов обрабатывали в течение 5-10 дней 3-5 раз ежедневно фармацевтическим препаратом в соответствии с изобретением. Клинические пробы проводили по методу doppelt blinden. Сравнивали степень действия препарата по примеру 1 (А) с торговой мазью, содержащей 5-иод-2^'-β -дезоксиуридин (С) и с плацебомазью (В), которая не содержала никакой активной составной части. Результаты клинических проб приведены в табл.5.

А мазь, содержащая 5-изопропил 2^'- β-дезоксиуридин
В мазь, не содержащая активную составную часть (плацебомазь)
С мазь, содержащая 5-иод-2^'-β -дезоксиуридин (положительный контроль).

Главные преимущества препарата и способа:
активная часть препарата быстро и селективно ресорбируется с кожи и в ней аккумулируется, так что целевое действие препарата может быть достигнуто с препаратом, который имеет низкую концентрацию активной составной части;
благодаря наружному применению препарата количество активной составной части меньше, чем при использовании препаратов, применяемых внутрь;
активная составная часть препарата является очень стабильной. Эта стабильность приводит к хорошим результатам, которые достигаются с препаратами с более низким содержанием активной составной части.

П р и м е р 1. Мазь для дерматологических целей, содержит, г: 5-Изопропил-2^'-β -дезоксиуридин 8 Полисорбат 60 36 Жидкий парафин 50 Цетил-стеариловый спирт 80 Белый вазелин 100 Глицерин 200 Моностеарат глицерина 20 Белый воск 4 Метиловый эфир п-оксибен- зойной кислоты 2 Дистиллированная вода 500
Мазь при комнатной температуре хранится без изменения по крайней мере два года.

П р и м е р 2. Гель для дерматологических целей, содержит, г:
5-Изопропил-2^'- β-дезокси- уридин 1,0 Метилцеллюлоза 4,0 Глицерин 20,0 Дистиллированная вода 73,9 Натрий-бензоат 0,1 Этанол (96%) 0,9
Этиловый эфир п-оксибен- зойной кислоты (нипагин) 0,1
П р и м е р 3. Мазь для офталь-
мологических цепей содержит, г: 5-Изопропил-2^'- β-дезоксиуридин 0,8 Оссulentum Simplex 999,2
Состав оцулентум симплекс следующий, г: Спирты шерстяного воска 50 Жидкий парафин 250 Белый вазелин 700
П р и м е р 4. Приготовление мази "хевицоз". В 10 г мази содержится, г: 5-Изопропил-2^'-β -дезоксиуридин 0,08 Сорбоксэтенстеарат (Твин 60) 0,36 Парафиновое масло 0,50 Цетилстеариловый спирт 0,80 Белый вазелин 1,0 Глицерин 2,0 Моностеарат глицерина 0,20 Белый воск 0,04 Метил-п-гидроксибензоат (нипогин М) 0,02 Дистиллированная вода 5,0
Методика приготовления. А. Водная фаза. 150 л деионизованной воды отмеряют в соответствующую емкость стерилизуют 20 мин при 125^оС и после охлаждения до температуры ниже 100^оС воду порциями вводят в раствор 0,6 кг метил-п-гидроксибензоата в 60 кг глицерина, нагретого до 80^оС. Полученный раствор хранят при 75-80^оС до использования.

Б. Жирная фаза. Сплавляют 24 кг цетилстеарилового спирта, 30 кг белого вазелина, 15 кг парафинового масла, 1,2 кг белого воска, 6 кг моностеарата глицерина и 8,7 кг сорбоксэтенстеарата. Полученный плав хранят при 75-80^оС до применения.

В. Приготовление суспензии, содержащей активный компонент. 2,1 кг сорбоксэтенстеарата гомогенизируют с 2,4 кг 5-изопропил-2^'-β -дезоксиуридина и после добавления 15 л воды нагретой до 40-50^оС, измельчают в коллоидной мельнице с использованием зазора размером 100 мкм до тех пор, пока при микроскопических анализах больше не обнаружат частиц с размером более 100 мкм. Затем измельчение продолжают, постепенно уменьшая зазор до 10 мкм. Суспензию выдерживают до последующего применения при 40-50^оС.

Г. Приготовление мази. Водную фазу, имеющую температуру выше на 4-5^оС, порциями добавляют к жировой фазе при перемешивании, после чего охлаждают до 40^оС и добавляют порциями при непрерывном перемешивании суспензию, содержащую активный компонент, после чего смесь гомогенизируют в коллоидной мельнице. Гомогенизат постепенно охлаждают до 20-25^оС и дозируют в ампулы по 10 г.

Температурный интервал 40-50^оС существен, так как при более высоких температурах активный компонент растворяется и после охлаждения выпадает в форме длинных игольчатых кристаллов, при этом распределение частиц по размерам, которое важно с позиции абсорбции, нельзя поддержать.

Изобретение относится к области медицины и касается наружно применяющегося, аккумулирующегося в коже активируемого средства. Цель - повышение стабильности. Сущность изобретения: антивирусное средство состоит из 0,02-5 мас. % 5-изопропил 2′ - β - дезоксиуридина в смеси с носителями, употребляющимися для получения наружно применяемых фармацевтических препаратов. 5 табл.

АНТИВИРУСНОЕ СРЕДСТВО на основе производного дезоксиуридина, отличающееся тем, что, с целью повышения стабильности, в качестве производного дезоксиуридина содержит 5-изопропил-2'- β -дезоксиуридина и наполнитель при следующем содержании компонентов, мас.

5-Изопропил 2'- b -дезоксиуридина 0,02 5,00
Наполнитель Остальное