СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРОПОРФИРИНА Российский патент 1996 года по МПК C12P17/16 

Изобретение относится к методам получения порфиринов путем микробиологического синтеза. Оно может быть использовано в медицине, где порфирины можно использовать как стандарты при анализе эндогенных порфиринов, в качестве люминесцентной метки при проведении иммуноанализа; в пищевой промышленности как красители; в других отраслях промышленности в качестве катализаторов окислительно-восстановительных реакций, каталитической реакции передачи цепи при радикальной полимеризации и аналитических реагентов при обнаружении ионов тяжелых металлов.

Известны способы получения смеси порфиринов, содержащей уропорфирин и копропорфирин, путем культивирования бактерий рода Arthrobacter hyalinus Arthrobacter pascens. Дальнейшее разделение порфиринов проводится высаживанием их из культуральной жидкости при различных значениях рН. Копропорфирин III выпадает в осадок в интервале рН 4-6, а уропорфирин III высаживают при рН 1-4. Эти методы не дают высокой степени очистки обоих порфиринов.

Согласно другому способу те же культуры в присутствии L-цистеина продуцируют уропорфирин III, время инкубации составляет от 2 до 30 дней. Недостатками этих способов являются длительный срок инкубирования, сопряженный с возможностью заражения культуры посторонней микрофлорой, а также образование смеси порфиринов, содержащей от 4 до 8 свободных карбоксильных групп, разделение которой потребовало создания специального полимерного носителя.

Наиболее близким решением, выбранным за прототип, является способ получения уропорфирина, основанный на энзиматической трансформации 5-аминолевулиновой кислоты, осуществляемой препаратом, полученным путем обработки биомассы трехсуточной культуры Propionibacterium shermanii M-82 ацетоном, охлажденным до -20^оС. Содержание уропорфирина составило 20 мг/л в расчете на 5-АЛК. Соотношение изомеров уропорфирина I и III, определенное с помощью ВЭЖХ, составило 4:1.

Недостатком этого метода является низкое содержание уропорфирина в культуральной жидкости, что затрудняет его выделение прямым осаждением и требует применения ионообменных смол, талька и других материалов.

Целью изобретения является повышение содержания уропорфирина в культуральной жидкости, создание устойчивого ферментного препарата, подлежащего длительному хранению (до 3 месяцев) для использования его по мере надобности.

Предлагаемый способ заключается в том, что ферментативную трансформацию 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК) осуществляют сухим препаратом биомассы культуры Arthrobacter globiformis BKM-658 (известный коллекционный штамм, применяется как продуцент копропорфирина, авт. св. СССР N 1482946), приготовленным путем обработки клеток этой культуры ацетоном, охлажденным до -20^оС и ниже. Саму культуру выращивают в течение 6 сут при 28^оС на среде, содержащей кукурузный экстракт или пептон. По окончании выращивания культуры клетки отделяют, промывают, центрифугируют. Отмытые клетки обрабатывают ацетоном, охлажденным до (-20)- (-25)^оС и ниже. Осадок ("ацетоновый порошок") отфильтровывают, сушат, хранят при -5^оС. Ферментный препарат с 5-АЛК инкубирую в фосфатном буфере в течение 48 ч. При этом происходит трансформация 5-АЛК (I) в уропорфирин (II),
_III
содержание которого в культуральной жидкости составляет 200-220 мг/л. Способ позволяет получать уропорфирин, свободный от других карбоксилсодержащих порфиринов с достаточно высоким выходом, сокращает время инкубирования и расход сырья. Синтезируемый продукт состоит из смеси изомеров стадии I и III. С помощью метода ВЭЖХ установлено, что соотношение изомеров I и III уропорфирина составляет 4: 1. Наличие в смеси только уропорфирина и отсутствие копропорфирина показано с помощью физико-химических методов.

Последовательность операций осуществления данного способа изложена в примере.

П р и м е р 1. Культуру Arthrobacter globiformis BKM-658 выращивают в течение 6 сут при 28^оС на среде следующего состава, глюкоза 1% кукурузный экстракт 6% аммоний сернокислый 0,1% Выращивание проводят в колбах Эрленмейера на 750 мл, заполненных 100 мл опытной среды, на качалках со скоростью встряхивания 180 об/мин. рН среды 7,2-7,4. Всего в опыте было 10 колб с общим объемом среды 1,0 л. Через 3 сут. выращивания проводят корректировку рН среды до 7,2-7,4 с помощью 10%-ного раствора бикарбоната натрия. Одновременно вносят 1,0% глюкозы. Эта процедура повторяется ежедневно до окончания культивирования.

По окончании выращивания культура из 10 колб объединяется в одной емкости и клетки отделяют на центрифуге с охлаждением (4^оС) при 5000 об/мин в течение 15 мин. Отделенные клетки промывают 3-4 раза по 500 мл 0,05 М калий-натрий-фосфатным буфером (рН 7,2-7,4), содержащим хлорамфеникол в количестве 20 мг/100 мл буфера. Отмывание проводят до полного отсутствия флуоресценции в ультрафиолетовом свете порфиринов, представленных в основном копропорфирином III, в промывных водах. Центрифугирование во всех случаях проводят на центрифуге с охлаждением (4^оС).

Отмытые клетки суспендируют в 150 мл вышеупомянутого фосфатного буфера (консистенция густой сметаны) и при помешивании вливают в стакан с 2,0 л ацетона, предварительно охлажденного в камере с сухим льдом до -25^оС. Полученный осадок после 30-минутного выдерживания при -25^оС и помешивании отделяют на воронке Бюхнера и тщательно отмывают охлажденным до -25^оС ацетоном до отсутствия флуоресценции порфиринов в фильтрате.

Препарат переносят с воронки Бюхнера на чашку Петри и высушивают в эксикаторе, заполненном безводным хлористым кальцием и парафином, при 4^оС.

В результате из 1,0 л растущей культуры Arthrоbacter globiformis было получено 60 г сырой биомассы, а из последней 7,0 г конечного сухого препарата ("ацетонового" порошка).

1,0 г ацетонового порошка растирают в фарфоровой ступке в 250 мл КNa-фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 20 мг/100 мл хлорамфеникола и 60 мг/100 мл восстановленного глутатиона.

После 30 мин прединкубации вышеупомянутой смеси при 37^оС в нее вносят 5-АЛК в количестве 30 мг/100 мл и продолжают инкубацию в течение 48 ч при 37^оС.

По окончании инкубации добавляют к смеси раствор трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации 5% Смесь выдерживают на холоду (4^оС) в течение 1 ч и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин. Осадок отделяют и в супернатанте определяют содержание порфиринов. В данном примере 50 мг в 250 мл супернатанта. Последний разбавляют в 3 раза дистиллированной водой.

К 750 мл водного раствора порфирина добавляют 40%-ный раствор едкого натра до рН 3,0. Оставляют на сутки при (4^оС), выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой с рН 3,0 и сушат в эксикаторе над серной кислотой. Полноту высаживания уропорфирина из культуральной жидкости проверяют спектрофотометрически по полосе Соре. Высушенный уропорфирин этерифицируют смесью метанол серная кислота (95:5, v/v) в течение 1 сут. Реакционную массу разбавляют водой, октаметиловый эфир уропорфирина экстрагируют хлороформом и очищают хроматографией на окиси алюминия III степени активности (проявитель хлороформ). После упаривания растворителя вещество перекристаллизовывают из смеси хлороформ метанол (1:5, v/v). Вес 39 мг (что соответствует содержанию в исходном растворе 280 мг/л): т.пл. 300-302^оС. Т.пл. ОМЭ уропорфирина III 265^oC, т. пл. ОМЭ уропорфирина I 302^oC. Электронный спектр, λ_макс. (ε х 10^-3), нм: 404 (217), 500 (15,74), 534 (9,45), 570 (6,87), 625 (4,17). Масс-спектр, м.в._рассч. 943,0; м.в._найд. 942,2. Найдено, C 61,00; H 5,78; N 5,87. C₄₈H₅₄N₄O₁₆. Вычислено, C 61,14; H 5,77; N 5,94.

ТСХ на пластинках "Алуфол" в системе хлороформ гексан (4:1) R_f 0,65. На пластинках "Силуфол" в системе хлороформ метанол (9,5:0,5) R_f 0,4.

Для установления изомерного состава ОМЭ уропорфирина его омыляют 25%-ной соляной кислотой. Идентификацию проводят с кислотами уропорфирина I и уропорфирина III фирмы Sigma и образцом, полученным из пера турако на пластинках "HPTLC Kieselgel 60F 254" в системе хлороформ метанол вода (65:25:4) и на пластинках с целлюлозой в системе 2,6-лутидин вода (5:3,5), насыщ. парами NH₃. Оказалось, что уропорфирин, полученный микробиологическим путем, является смесью изомеров уропорфирина. Окончательная идентификация изомерного состава уропорфирина подтверждена с помощью ВЭЖХ на микроколоночном хроматографе НР 1090М (Hewlett Packard) в условиях разделения. Колонка ODS Hypersil, 5 мкм, 2,1 х 100 мм. Скорость потока 0,25 мл/мин. Элюент: A 1 M ацетат аммония, рН 5,18; Б метанол.

На фиг.1 и 2 приведены хроматограммы смеси стандартов порфиринов уропорфиринов I, III; копропорфиринов I, III; протопорфирина IX (фиг.1) и изомеров уропорфирина I, III (фиг.2) (таблица).

Использование: в медицине. Сущность изобретения: уропорфирин получают ферментативной трансформацией 5-аминолевулиновой кислоты, которую осуществляют препаратом биомассы клеток Arthrobacter globiformis ВКМ-658, полученным путем обработки клеток ацетоном, охлажденным до температуры ниже минус 20^oС (ацетоновый порошок). 2 ил., 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРОПОРФИРИНА, предусматривающий ферментативную трансформацию 5-аминолевулиновой кислоты сухим препаратом биомассы клеток микроорганизмов, полученным обработкой клеток ацетоном, охлажденным до температуры ниже минус 20^oС, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма используют культуру Arthrobacter globiformis ВКМ-658.