СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ВИРУСОВ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к области биохимии вирусов, преимущественно иммунохимии вирусов, и может быть использовано в различных областях вирусологии, медицины, сельского хозяйства, ветеринарии, микробиологической промышленности, контроля окружающей среды для безинструментального экспресс-анализа широкого круга вирусов.

Известны различные способы диагностики вирусных инфекций. Среди них - тесты на растениях- и животных-индикаторах, электронная микроскопия, а также различные серологические методы капельная преципитация, иммунодиффузия в агаре, латексаглютинация. Каждый из этих методов при несомненных достоинствах отличается отдельными недостатками: неколичественностью определения, относительно низкой чувствительностью и специфичностью, длительностью и трудоемкостью серийных определений.

Для проведения массовых анализов наиболее эффективным методом иммунодиагностики вирусов является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на использовании иммобилизованных на твердой фазе антител и антител, меченных молекулой фермента.

Существенным недостатком этих методов является значительная длительность анализа (от нескольких часов до нескольких суток).

Также известен гомогенно-гетерогенный способ иммуноанализа вирусов, включающий стадию добавления в исследуемый образец антител, меченных ферментом, с последующим проведением иммунохимической реакции в растворе и разделением компонентов иммунологической смеси путем последовательного добавления синтетических водорастворимых полиэлектролитов (полианиона и поликатиона) и определения исследуемого вируса по концентрации фермента-маркера в супернатанте или перерастворенном осадке. Недостатком этого способа является методическая сложность количественного отделения высокодисперсного микроосадка полиэлектролитного комплекса с использованием традиционных методов центрифугирования и ультрафильтрации при проведении массовых измерений. Отсутствие соответствующего отечественного оборудования, позволяющего количественно и быстро проводить декантацию большого числа исследуемых образцов, делает метод трудоемким. Проведение массовых аналитических измерений доступно лишь для незначительного числа хорошо оснащенных диагностических центров. Время анализа в данном способе лимитируется длительностью отделения микроколичеств нерастворимого стехиометричного комплекса, его отмывкой и определением ферментативной активности в перерастворенном осадке. Кроме того, многостадийность метода осложняет возможность полной автоматизации проводимых измерений.

В качестве прототипа предлагается способ иммуноанализа биологически активных веществ. Анализ осуществляют следующим образом. К исследуемому образцу добавляют антитела, ковалентноиммобилизованные на водорастворимом синтетическом полианионе, например полиметакриловой кислоте, и конъюгат антител, меченных ферментом. После образования водорастворимых иммунокомплексов определяемого вируса с меченными и иммобилизованными антителами раствор добавляют на нерастворимый положительно заряженный носитель, вследствие чего компоненты смеси связанные с иммобилизованными, адсорбируются на положительно заряженной твердой фазе в результате кооперативных ионных взаимодействий с молекулами отрицательно заряженного полианиона, содержащего иммунокомплекс определяемого вируса с меченными ферментом антителами. В качестве положительно заряженных носителей используются нитро- и ацетатцеллюлозные мембраны, обработанные водорастворимыми поликатионами поли-4-винилпиридином, хитозаном и полиэтиленимином и др. После добавления иммунохимической смеси к модифицированному твердофазному положительно заряженному носителю его промывают с целью удаления неспецифически связавшегося конъюгата антител с ферментом, затем на него наносят раствор субстрата фермента и определяют количественно концентрацию образовавшегося продукта реакции, которая пропорциональна концентрации определяемого вируса и служит характеристикой его содержания в исследуемом образце. Концентрацию определяемого вируса в исходной смеси вычисляют по калибровочному графику, построенному с использованием стандартных препаратов.

К недостаткам этого метода следует отнести многостадийность проведения анализа, включающего в себя активацию мембраны раствором поликатиона (1 2 ч), отмывку мембраны от избытка поликатиона, проведение иммунологической реакции в растворе (10 20 мин), разделение компонентов иммунологической смеси на модифицированной мембране, отмывку мембраны от неспецифически связавшегося конъюгата, проведение ферментативной реакции в гетерогенной смеси (30 мин) и определение оптической плотности продукта ферментативной реакции. Кроме того, использование положительно заряженных нитро- и ацетатцеллюлозных мембран в прототипе не исключает возможности значительной неспецифической сорбции компонентов иммунохимической смеси в связи с чем необходимо проводить дополнительно стадию блокирования заряженных мембран в 3% растворе сывороточного альбумина в течение 1 ч, что создает неудобства при проведении массовых анализов. Таким образом, многостадийность проведения анализа и многокомпонентность аналитической системы осложняет возможность полной автоматизации метода и делает его непригодным для использования в нелабораторных условиях.

Кроме того, при разделении компонентов иммунологической реакции его прототипу необходимо использовать высокие концентрации синтетических полиэлектролитов. Использования высокоочищенных синтетических полиэлектролитов (полиметакрилата натрия с м.в. 240 кДа) для иммобилизации антител значительно увеличивает стоимость анализа по прототипу и существенно осложняет приготовление реагентов с заданными характеристиками, что делает такие методы неудовлетворительными для целей практической вирусологической диагностики.

Задачей изобретения является разработка простого и дешевого способа количественного определения вирусов с визуальной регистрацией результатов анализа, при котором существенно упрощается метод проведения анализа, снижается его стоимость, делая предлагаемый метод пригодным для массовых внелабораторных и полевых измерений.

Способ осуществляют следующим образом. На стартовую линию нитроцеллюлозной (или полиамидной) мембраны наносят 0,005 мл раствора меченных антител. На расстоянии 1 см ниже стартовой линии наносится 0,005 мл исследуемого образца (растительный сок, экстракт и т.д.) (см. чертеж). Во время движения фронта растворителя сверху вниз меченые антитела, мигрируя вдоль поверхности мембраны вместе с растворителем взаимодействуют с определяемым вирусом, который находится на пути их движения. Образующийся в потоке растворителя иммунокомплекс меченых антител с вирусными частицами также как и исходный вирус не способны мигрировать в сетчатом слое нитроцеллюлозы из-за высокого молекулярного веса определяемого антигена. При этом несвязавшийся конъюгат уходит вместе с током растворителя дальше зоны нанесения вирусного образца. Выявление распределения фермента-маркера по хроматографической поверхности проводят с использованием субстратных систем, приводящих к образованию нерастворимого продукта, что позволяет визуально оценивать результаты анализа. О содержании вируса судят по интенсивности образующегося окрашивания в месте нанесения исследуемой пробы. Чем выше концентрация вируса в исследуемом образце, тем интенсивнее образующаяся окраска в этой зоне. Регистрация интенсивности окраски поверхности хроматографического носителя в отраженном свете (а не на пропускание, как это имеет место при сравнении окраски жидких образцов в способе-прототипе) позволяет с большей точностью проводить сравнение исследуемых образцов со стандартами.

На чертеже представлена схема проведения иммунохроматографического анализа вирусов.

В качестве фермента-маркера (Е) могут быть использованы щелочная фосфатаза из кишечника теленка (1000 25001U/мг м.в. 100 кДа) или пероксидаза хрена (500 1000 IU/мг, м.в. 40 кДа). Для детекции щелочной фосфатазы в предлагаемом методе могут быть использованы следующие субстратные системы, дающие водонерастворимый окрашенный продукт ферментативной реакции: альфа (бета) нафтилфосфат, прочный голубой (FACT BLUE); нафтол-AS-MX-фосфат и прочный красный (Fast Red); нитроголубой тетразолий и 5-бром-4-хлориндолилфосфат и др. Для пероксидазы хрена наиболее распространенным субстратом является диаминобензидин в присутствии перекиси водорода и хлористого кобальта. Предлагаемый метод не исключает использование как других ферментных маркеров антител: бета-галактозидаза из E. Coli (субстрат-5-бром-4-хлор-4-иидолилбета-Д-галактопиранозид в комбинации с солями тетразолия); глюкозооксидаза (субстрат-Д-клюкоза и 4-хлоро-1-нафтол), так и различных красителей и окрашенных латексов для визуальной оценки результатов количественных вирусологических измерений.

Пример 1. Анализ X-вируса картофеля (ХВК).

В качестве антител используют гамма-глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки к ХВК с титром от 1-10⁵. Гамма-глобулиновую фракцию сыворотки крови выделяют двухкратным осаждением 20% водным раствором полиэтиленгликоля (м.в. 6 кДа) с последующим диализом против 0,01 М К-фосфатного буфера (0,1 М NaCl) pH 7,4 7,8.

В качестве фермента-маркера используют щелочную фосфатазу из кишечника теленка (1000 2500 IU/мг). Введение ферментной метки в молекулу антител проводят с помощью гетеробифункционального сшивающего агента-3-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида, который последовательно взаимодействует с аминогруппами фермента и SH-группами частично восстановленных молекул антител.

В качестве антигена используют высокоочищенный препарат ХВК. Препаративное выделение очищенных экстрактов ХВК, его очистку и концентрирование проводят по стандартной методике, используя несколько циклов дифференциального центрифугирования.

Растительный сок получают, растирая материал в фарфоровой ступке с добавлением 0,01 М К-фосфатного буфера (0,1 М NaCl, 0,1% тритон Х-100) pH 7,4 в соотношении 1 5 (растительная масса/объем буфера). Полученные экстракты осветляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 5 мин.

В качестве хроматографического носителя используют нитроцеллюлозные мембраны с диаметром пор 5,0 8,0 мкМ.

В качестве растворителя (подвижной хроматографической фазы) используют 0,01 М К-фосфатный буфер (0,1 М NaCl, 0,1% тритон Х-100 pH 7,8.

На стартовую линию хроматографической поверхности наносят 0,005 мл раствора меченых антител (10^-7 10^-8 М по ферменту-маркеру) в 0,01 М К-фосфатном буфере (0,1 М NaCl, 0,1% тритон Х-100) pH 7,8. На расстоянии 1 см ниже стартовой линии наносят 0,005 мл раствора исследуемого растительного сока (или стандартный препарат вируса, разведенный в соке здорового растения). На верхнюю часть мембраны постепенно наносят растворитель, избегая его быстрого растекания по мембране. Скорость миграции фронта растворителя вдоль поверхности нитроцеллюлозной мембраны не должна превышать 2 см/мин. После достижения растворителя нижней границы мембраны хроматографическую полоску помещают в субстратную смесь, содержащую Fast Blue RR (1 мг/мл) и альфа-нафтилфосфат (1,25 мг/мл) в 0,1 М трис-HCl, буфере ph 9,0 9,3. Детекцию ферментной метки на мембране осуществляют визуально в месте нанесения исследуемой пробы по интенсивности окрашивания образующегося нерастворимого пигмента. Пересчет интенсивности окраски мембраны в концентрацию измеряемого ХВК проводят по калибровочному графику (или с использованием цветных таблиц при визуальной регистрации результатов анализа), полученному с использованием стандартных препаратов ХВК.

Чувствительность метода составляет 20 нг/мл ХВК в исследуемом образце. Время анализа не превышает 10 мин.

Пример 2. Анализ Y-вируса картофеля (YВК).

В качестве антител используют гамма-глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки к УВК с титром 1-10⁵.

В качестве фермента-маркера используют пероксидазу хрена (ЕС 1,11.1,7) с RZ 3,0 3,1.

В качестве антигена используют высокоочищенный вирусный препарат УВК. Препаративное выделение УВК проводят по стандартной методике.

В качестве хроматографического носителя используют полиамидные мембраны с диаметром пор 5,0 8,0 мкм.

Конъюгат иммуноглобулинов с пероксидазой получают методом окисления углеводного компонента фермента периодатом натрия.

Приготовление остальных растворов и реагентов для анализа УВК, а также проведение анализа осуществляют согласно примеру 1.

Детекцию ферментной метки на хроматографической мембране осуществляют путем инкубации ее в растворе субстратов, содержащем 3,3'-диаминобензидин (0,5 мг/мл), перекись водорода (10 мМ) и CoCl₂ (0,2%). Пересчет интенсивности окрашивания мембраны в области нанесения исследуемого образца проводят по калибровочному графику (или визуально), полученному с использованием стандартов УВК. Чувствительность метода составляет 30 нг/мл УВК в исследуемом образце. Время проведения анализа не превышает 10 мин.

Пример 3. Анализ S-вируса картофеля (SBK).

В качестве антител используют гамма-глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки к SBK.

В качестве контроля при тестировании SBK в очищенных препаратах используют очищенные гетерологичные вирусы XBK и YBK. При анализе растительного материала, зараженного YBK, контролем служат листья и клубни здоровых растений картофеля.

В анализе используют капроновые, нейлоновые или нитроцеллюлозные мембраны с диаметром пор 5,0 8,0 мкм.

В качестве фермента-маркера используют щелочную фосфатазу из тонкого кишечника крупного рогатого скота. Введение ферментной метки в молекулу антител осуществляют методом с использованием глутарового альдегида.

Приготовление остальных растворов и реагентов для анализа SBK, а также проведение анализа осуществляют согласно примеру 1.

Детекцию ферментной метки на мембране осуществляют визуально в месте нанесения исследуемой пробы по интенсивности образующегося окрашивания, после инкубации хроматографической мембраны в субстратной смеси: Fast Red (1 мг/мл), нафтил-AS-MX-фосфат (0,2 мг/мл) в 0,1 М трис-HCl буфере pH 8,2. Чувствительность анализа составляет 30 нг/мл, время анализа не превышает 10 мин.

Пример 4. Анализ М-вируса картофеля (МВК).

В качестве антител используют гамма-глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки к МВК.

В качестве контроля при анализе растительного материала, зараженного МВК, используют листья и клубни здоровых растений картофеля.

В анализе используют нитроцеллюлозные мембраны с диаметром пор 5,0 8,0 мкм.

Приготовление остальных растворов и реагентов для анализа МВК, а также проведение анализа осуществляют согласно примеру 1.

Чувствительность определений составляет 30 нг/мл МВК в исследуемом образце. Время анализа не превышает 10 мин.

На примере ряда вирусов X, Y, M, S картофеля, различающихся по целому ряду биологических и физико-химических свойств (X-вирус картофеля относится к группе потексвирусов с размером вирионов 515х15 нм, Y-вирус картофеля относится к группе потивирусов с размером вирионов 730х11 нм, M- и S-вирусы картофеля являются представителями группы карлавирусов с размером 650х12 нм) предложен новый иммунохроматографический экспресс-метод анализа вирусов, пригодный для массового скрининга образцов, содержащих до 20 30 нг/мл вируса. Предложенный метод позволяет проводить измерения за время, не превышающее 10 мин.

Экспрессность метода и отсутствие необходимости в каком-либо специальном оборудовании, а также возможность проведения анализа в полевых и внелабораторных условиях обусловливает целесообразность применения таких систем в массовой вирусологической практике.

Использование: вирусология. Сущность изобретения: способ количественного определения растительных вирусов предусматривает нанесение на полимерную мембрану образца, содержащего определяемый вирус, и меченых антител, проведение иммунохимической реакции и отделение иммунохимического комплекса одновременно в процессе хроматографической миграции на поверхности мембраны с размером пор 5,0 - 8,0 мкм. 1 ил.

Способ количественного определения растительных вирусов, предусматриывающий нанесение на полимерную мембрану образца, содержащего определяемый вирус, и меченых антител, проведение иммунохимической реакции, отделение иммунохимического комплекса от несвязавшихся меченых антител и регистрацию метки, отличающийся тем, что иммунохимическую реакцию и отделение иммунохимического комплекса осуществляют одновременно в процессе хроматографической миграции на поверхности мембраны с размером пор 5,0 8,0 мкм.