СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛИНА Российский патент 1995 года по МПК A61K39/04 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к получению биологического препарата для аллергической диагностики туберкулеза у животных.

Известен способ получения туберкулина [1] путем обработки инактивированных клеток Mikobacterium tuberculosis органическими растворителями, при этом фильтрат хроматографически очищают и выделяют целевой продукт кристаллизацией.

Однако использование органических растворителей требует специального оборудования, значительно ухудшает санитарно-гигиенические условия труда и экологию окружающей среды.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ получения очищенного туберкулина, представляющего собой раствор белковых фракций, выделенных химическим путем из культурального фильтрата туберкулеза, выращенного на синтетической питательной среде (среда Курской биофабрики с аспарагином), осаждением белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ кислотой) или сернокислым аммонием с последующей очисткой его путем многократного переосаждения [2]
Однако для указанного способа характерна недостаточная специфичность препарата и небольшой выход доз препарата с 1 л питательной среды.

Целью изобретения является увеличение выхода туберкулина и повышение его специфичности.

Указанная цель достигается тем, что при получении туберкулина из культурального фильтрата по предлагаемому способу производится предварительное концентрирование культурального фильтрата с последующим осаждением белка ТХУ кислотой в конечной концентрации кислоты в фильтрате 8-10% переосаждение белка сернокислым аммонием проводится при нейтральных значениях рН (вместо рН 4-5 по прототипу); а прогрев стандартного раствора туберкулина до 80-90^оС позволяет стабилизировать белок без стабилизирующих добавок (например Твин-80).

Предлагаемый способ соответствует критерию "Новизна", так как среди общедоступных источников информации не было обнаружено способа получения туберкулина с такой же совокупностью признаков.

Предлагаемый способ так же соответствует критерию "изобретательский уровень", так как его решение не вытекает явным образом из уровня техники. Известные способы получения туберкулина обладают другими совокупностями признаков, не приводящими к высоким качественным результатам.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Готовят матриксную расплодку на синтетической питательной среде (среда Курской биофабрики с аспарапином). Осуществляют производственный посев и инкубируют культуру в течение 6-8 недель при 37^оС. Стерилизуют посевы в течение 30 мин при 120^оС или в течение 3 ч при 100^оС. Концентрируют культуральный фильтрат на ультрафильтрационных мембранах с задерживающей способностью 15 000 Да в 10 раз. Осаждают из концентрата белок 50%-ным раствором ТХУ кислоты в конечной концентрации последней 8-10% После центрифугирования осадок растворяют из расчета 1 ч. белка и 6-10 ч. дистиллированной воды при подщелачивании 10%-ным раствором аммиака (ГОСТ 3760-79) до рН 7,4-7,6. Переосаждают белок равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония (ГОСТ 3769-78) при нейтральных значениях рН. Белок после центрифугирования растворяют в дистиллированной воде в соотношении (1:5)-(1:7); обессоливают белок электродиализом. Стерилизуют раствор белка. Раствор туберкулина разбавляют разбавителем, представляющим собой раствор хлористого натрия (ГОСТ 4233-77), глицерина (ГОСТ 6824-76 или ГОСТ 7482-76) и фенола (ГОСТ 6417-72) в деминерализованной воде (ГОСТ 6709-72). Получают стандартный раствор белка с содеражнием в 1 мл раствора 0,826 мг белка, 0,85 мг хлорида натрия, 1 мг глицерина и 0,3 мг фенола.

П р и м е р 1. Синтетическую питательную среду засевали пленкой культуры, адаптированной в этой питательной среде. Производили производственный посев и инкубирование в течение 7 недель при 37,5^оС. Для изготовления туберкулина использовали культуры возбудителя туберкулеза бычьего вида с типичным ростом и накоплением белка не менее 40 мг. Культуры стерилизовали при 100^оС, в течение 3 ч. Для удаления бактериальной массы стерилизованную культуру фильтровали. Культуральный фильтрат концентрировали на ультрафильтрационных мембранах в 10 раз. Из сконцентрированного фильтрата культуральной жидкости производили осаждение белка 50%-ной ТХУ кислотой, в конечной концентрации кислоты в фильтрате 7,5% Перемешивали фильтрат в течение 4 мин с интервалом 15 мин и отстаивали 16 ч при 10^оС. Осадок собирали и центрифугировали.

Осадок растворяли в дистиллированной воде из расчета 1 ч. белка и 6 ч. воды и подщелачивали 10%-ным раствором аммиака до рН 7,4.

Раствор белка смешивали с равным объемом насыщенного раствора сернокислого аммония (стерилизация автоклавированием при 1 атм в течение 30 мин), перемешивали 3 раза через 15 мин и отстаивали 10 ч при 5^оС. Надосадочную жидкость удаляли, осадок растворяли в дистиллированной воде в соотношении 1: 6, рН доводили до 7,4.

Раствор белка обессоливали электродиализом в течение 3,5 ч. После обессоливания раствор белка сливали в бутылки, тщательно перемешивали, подщелачивали 10%-ным раствором аммиака до рН 7,0 и проводили стерилизующую фильтрацию в стерильные емкости. Таким образом, получали концентрированный раствор очищенного туберкулина.

В реактор с разбавителем (представляющим собой раствор в деминерализованной воде хлористого натрия 0,85% глицерина 10% и фенола 03,), охлажденным до 13^оС, при включенной мешалке со скоростью 60 об/мин вакуум-насосом засасывали концентрат туберкулина до конечной концентрации 50 000 МЕ и перемешивали в течение 30 мин.

Таким образом получали стандартный раствор белка с содержанием в 1 мл раствора 0,826 мг белка, 0,85 мг хлорида натрия, 1 мг глицерина и 0,3 мг фенола, который с целью стабилизации белка прогревали до 80^оС, охлаждали до температуры окружающей среды и стерильно расфасовывали в пинициллиновые флаконы по 20 мл.

Результаты приведены в табл.1.

П р и м е р ы 2-6. Примеры выполнялись аналогично примеру 1. Изменяли лишь конечную концентрацию кислоты в фильтрате при осаждении белка из фильтрата культуральной жидкости 50%-ной ТХУ кислотой.

Результаты сведены в табл.1.

П р и м е р ы 7-13. Примеры выполнялись аналогично примеру 1. Изменяли лишь температуру стабилизации туберкулина. Активность препарата во всех примерах составила 50 000 МЕ.

Результаты зависимости активности туберкулина от температуры стабилизации белка после 3 мес хранения приведены в табл.2.

В качестве пояснения к примерам и таблицам необходимо отметить следующее.

Предварительное концентрирование культурального фильтрата на ультрафильтрационных мембранах с задерживающей способностью 15 000 Да уменьшает объем последнего. Экспериментами установлено, что оптимальным значением степени концентрации является 10. При большей кратности наблюдались значительные потери белка, меньшая не имеет смысла, так как увеличивает расход ТХУ кислоты, необходимой для осаждения белка. Уменьшение концентрации культурального фильтрата в 10 раз влечет за собой уменьшение количества ТХУ кислоты, необходимой для осаждения белка, в 10 раз. Во столько же раз уменьшается количество щелочи, необходимой для нейтрализации надосадочной жидкости, подлежащей утилизации.

Это позволяет сэкономить дефицитные и дорогие химреактивы, улучшает санитарно-гигиенические условия труда, уменьшает загрязнение окружающей среды.

Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы гидратных оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью и под действием различных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Одним из таких факторов является воздействие на молекулу белка ТХУ кислотой. При конечной концентрации кислоты 4-5% (прототип) осаждение белка не является полным. А большие концентрации кислоты приводят к необратимой денатурации белка.

Установлено, что оптимальной концентрацией для наиболее полного осаждения белка из культурального фильтрата, не подвергнутого необратимой денатурации, является концентрация ТХУ кислоты 8-10% Прямой зависимости количества осажденного белка от концентрации ТХУ кислоты авторы не наблюдали.

Переосаждение белка сернокислым аммонием при нейтральных значениях рН позволяет получить туберкулин с коэффициентом специфичности 1,1 в то время как при рН 4-5 (прототип) коэффициент специфичности 1,0.

Специфичность предлагаемого туберкулина проверена на 300 морских свинках, сенсибилизированных гетерогенными штаммами птичьего вида и гомогенными штаммами бычьего вида. Предлагаемый препарат дал достоверно более низкую реакцию в гетерогенной системе и имел активность, соответствующую контрольному препарату в гомогенной системе.

В процессе изготовления туберкулина в растворе обнаруживаются протеазы, ферменты, разрушающие белок. Прогрев стандартного раствора туберкулина до 80-90^оС позволяет их инактивировать, что приводит к его стабилизации.

Область применения: микробиология, биотехнология, получение биологического препарата для аллергической диагностики туберкулеза у животных. Сущность изобретения: при получении туберкулина из культурального фильтрата производят предварительное концентрирование последнего с последующим осаждением белка трихлоруксусной кислотой с конечной концентрацией кислоты в фильтрате 8 - 10%, переосаждение белка сернокислым аммонием проводят при нейтральных значениях pH, а прогрев стандартного раствора туберкулина до 80 - 90°С позволяет стабилизировать белок без стабилизирующих добавок (например, Твин-80). Туберкулин, получаемый по предлагаемому способу, имеет стабильную во времени активность и высокий коэффицент специфичности. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛИНА, включающий выращивание культуры микобактерий бычьего типа в синтетической питательной среде, инактивацию культуры, фильтрацию, отделение культурального фильтра с последующими осождением белка из фильтрата трихлоруксусной кислотой, очисткой раствором сернокислого аммония и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что культуральный фильтрат дополнительно концентрирует на мембране с порогом удерживания 15000 Д, для осаждения белка используют трихлоруксусную кислоту в конечной концентрации 8 10 об. очистку осуществляют при нейтральном или слабощелочных значениях рН, а полученный целевой продукт стабилизируют прогреванием. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стабилизацию проводят прогревом до 80 90^oС.