СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОАТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИМ, АНТИЛИТОГЕННЫМ, КАРДИОТОНИЧЕСКИМ, АНТИАЛЛЕРГИЧЕСКИМ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1995 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к производству лекарственных препаратов из растительного сырья.

Технический результат изобретения заключается в разработке препарата, обладающего одновременно пятью активностями.

Цель достигается экстракцией шрота чабреца (после получения экстракта чабреца) методом реперколяции в батарее из четырех перколяторов, разбавлении спиртового экстракта водой, отделении выделившегося осадка.

П р и м е р. В батарее из четырех перколяторов, загруженных по 25 кг шрота чабреца каждый, после экстракции травы чабреца 30% этанолом, проводят экстракцию этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент 1:5 методом реперколяции. Спиртовое извлечение из четвертого перколятора (125 кг) разбавляют водой (250 кг) до содержания этилового спирта 30% Выделившийся осадок отделяют, сушат и измельчают. Выход целевого продукта составляет 1250 г (5%).

Предлагаемый способ позволяет существенно повысить выход, расширить спектр фармакологического действия, а также значительно упростить технологическую схему получения целевого продукта.

По предлагаемому способу освобожденный от целевого продукта раствор 30% этилового спирта без дополнительной обработки используется далее для производства жидкого экстракта чабреца, применяемого в фармацевтической промышленности для получения лекарственного препарата Пектуссин.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить выход (на 25%), расширить спектр фармакологического действия, упростить технологическую схему получения целевого продукта, а также создать единый замкнутый цикл по комплексной и безотходной переработке растительного сырья травы чабреца.

Биологические исследования средства проводились в лабораториях Пятигорского фармацевтического института и аллергоиммунологическом центре г. Пятигорска.

Однократное введение средства способно отразиться на уровне сахара крови и содержании гликогена в мышцах, причем эти изменения зависят от дозы вводимого средства и различны в различных типах мышц. Повышение сахара в крови отмечалось лишь при введении 100 мг/кг средства (на 25,4% р < 0,001). Наряду с этим увеличение содержания гликогена в мышцах матки имело место при введении как 100 мг/кг средства (на 120,6% р<0,001), так и 10 мг/кг средства (на 45,7% р<0,001) в мышцах сердца наиболее отчетливо при введении 10 мг/кг средства (на 21,4% р<0,05), тогда как в мышцах бедра лишь при введении 100 мг/кг средства (на 42,9% р<0,01) (табл.1).

Более однородные результаты выявились при курсовом введении средства в дозе 10 мг/кг, характеризовавшемся повышением сахара крови (на 28,7% р<0,001), увеличением содержания гликогена в мышцах матки на 53,3% р<0,001), увеличением содержания гликогена в мышцах сердца на 34,2% (р<0,001), и в мышцах бедра на 32,1% (р< 0,001). Как при однократном, так и при курсовом введении средства бросается в глаза особенно выраженное повышение содержания гликогена в гладких мышцах матки, затем в мышцах сердца и (в наименьшей степени) в поперечно-полосатых мышцах бедра. Накопление гликогена в мышцах матки, сердца и соматических мышцах следует расценивать как биохимическую основу увеличения энергетических резервов этих органов.

Об увеличении энергетических резервов под влиянием приема средства указывает также характер сдвигов в содержании АТФ и активности АТФ-азы в исследуемых органах (табл.2). Обращает на себя внимание отсутствие существенных сдвигов в содержании АТФ в поперечно-полосатых мышцах бедра и отчетливое его увеличение в гладких мышцах матки и особенно в мышцах сердца, происходящее в последних даже при однократной даче средства. В мышцах сердца под влиянием однократного введения срества в дозе 10 мг/кг содержание АТФ возросло на 82,3% (р<0,01), а при введении в дозе 100 мг/кг на 123,3 (р < <0,001). Курсовое введение средства в дозе 10 мг/кг обусловило увеличение содержания АТФ на 81,1% (р<0,001). В мышцах матки повышение содержания АТФ происходило лишь при курсовом применении средства (на 192,3% р<0,001).

Накопление АТФ в мышце, по-видимому, в определенной мере связано со снижением активности АТФ-азы, наблюдавшейся в исследуемых тканях животных, получавших средство (табл. 3). В мышцах сердца активность АТФ-азы падала на 28,0% -33,8% В мышцах бедра наряду с падением активности АТФ-азы (на 41,3%-70,4% ), сохранялся обычный уровень АТФ, что зависело от замедления синтеза АТФ, наряду с замедлением его распада.

Таким образом, характерной особенностью действия средства является повышение энергетических ресурсов, причем в первую очередь в мышцах сердца и матки, наступающее почти сразу после введения даже при однократном приеме препарата и свидетельствует о его кардиотоническом действии.

Влияние средства на показатели углеводного обмена проводилось также у крыс с экспериментальной гиперхолестеринемией на трех группах животных (по 13-19 крыс в группе) обоего пола массой 200-250 г. Первая группа интактные крысы, вторая контрольные крысы с экспериментальной гиперхолестеринемией, которая вызывалась дачей с кормом в течение 130 дней холестерина в дозе 0,2 г/кг, веса, холевой кислоты 10 мг/кг, мерказолила 25 мг/кг, подсолнечного масла 0,5 мл (так называемая атерогенная диета), третья группа опытные крысы, получавшие с такой же атерогенной диетой средство в дозе 10 мг/кг. В этих опытах у крыс, получавших на фоне холестериновой диеты средство, показано увеличение сахара в сердце на 31,1% в сравнении с контрольными крысами (253±22,5 мг% против 193±14,7 мг% Р <0,05) и увеличение на 40,6% в сравнении с интактными крысами (253±22,5 мг% против 180±18 мг% р <0,02).

Полученные результаты, по-видимому, следует рассматривать как увеличение энергетических ресурсов организма под влиянием систематического приема тритерпенового препарата.

При проведении исследований в сыворотке крови определяли холестерин (по Мрскоса и Товарека, 1963), β-липопротеиды (по А.Н.Климову с соавт. 1966), фосфолипиды (по фосфору, определяемому по Фиске-Суббароу), вычисляли коэффициент холестерин/фосфолипиды, в ткани аорты определяли холестерин и β-липопротеиды (по Т.Н.Ловягиной и Э.Б.Баньковской, 1965), в тканях печени и сердца холестерин. Результаты полученных определений обрабатывали методом вариационной статистики.

Изучение действия исследуемого средства на показатели холестеринового обмена у здоровых животных было выполнено на 50 белых крысах. Средство вводили ежедневно в течение 9 дней через зонд в желудок в дозе 10 мг/кг в 0,5 подсолнечного масла. Контролем служили крысы, которым вводили подсолнечное масло, и интактные. Проведенное курсовое введение средства привело к достоверному уменьшению холестерина печени на 13%/330,6±8,3 мг. против 382,2±10,5 мг/, р <0,001, и не вызывало существенных изменений других определяемых показателей крови и органов.

Изучение гипохолестеринемического и противоатеросклеротического действия средства проводили в опытах на 47 кроликах. Препарат скармливали в дозе 10 мг/кг ежедневно в течение 2 мес на фоне даси холестерина (200 мг/кг) или в течение 1 мес после окончания предварительного двухмесячного скармливания холестерина.

При одновременном скармливании кроликам средства и холестерина происходило более медленное, чем в контроле (при скармливании кроликам только холестерина) развитие гиперхолестеринемии и гипербета-липопротеидемии (табл. 4). Содержание в крови холестерина к концу опыта отличалось от контроля на 57,96% (490±41:5 мг% в контроле и 206,2±15,5 мг% в опыте), р < < 0,001, содержание беталипопротеидов снизилось на 39,85% (652±44,6 мг% против 1084±142 мг% ), р <0,02, величина холестерин/фосфолипиды на 40,86% (1,10±0,08 против 1,86±0,084) р<0,001. Таким образом, введение средства значительно задерживало нарушение липидного обмена и развитие экспериментального атеросклероза.

Сходная картина наблюдалась и в опытах на крысах (табл.5). Экспериментальная гиперхолестеренемия у крыс вызывалась путем содержания животных в течение 130 дней на атерогенной диете, содержащей холестерин, мерказолил и холевую кислоту (из расчета соответственно 200 мг, 5 мг и 2 мг на одну крысу в день). Эти животные составляли контрольную группу. Крысы опытной группы на фоне описанной диеты получали исследуемый препарат в дозе 10 мг/кг. В качестве второй контрольной группы использовались также интактные крысы. Как показали эти опыты при введении крысам с пищей холестерина, мерказолила и холиевой кислоты наблюдалось статистически достоверное возрастание холестерина и беталипопротеидов сыворотки крови, холестерина аорты, печени и сердца по сравнению с этими показателями у интактных животных. Добавление к атерогенному корму средства уменьшало содержание холестерина и беталипопротеидов в сыворотке крови и холестерина в органах. Количество холестерина в сыворотке крови в опытной группе уменьшилось на 32,18% (49,1±4,2 мг% против 72,4±3,9 мг%) р <0,001, количество бета-липопротеидов уменьшилось на 26,85% (92,2±3,8 мг% против 127,8±6,9 мг% р<0,001). Содержание холестерина в аорте у опытных животных было на 28,52% ниже, чем у контрольных (219,6±9,5 мг% против 307,3±18,6 мг% р <0,001), а холестерина печени на 22,5% ниже (320,2±10,8 мг% против 413,3±31 мг% р < 0,001).

Значения всех определяемых показателей липидного обмена крыс опытной группы приблизились к их значениях у интактных животных, т.е. статистически достоверно от них не отличались. Последнее позволяет заключить, что как и у кроликов у белых крыс в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии исследуемое средство способно задерживать развитие нарушений со стороны липидного обмена.

Заслуживающие внимания результаты были получены также при применении средства в условиях обратного развития атеросклероза.

Скармливание в течение 30 дней средства (в дозе 10 мг/кг) кроликам с экспериментальным атеросклерозом после прекращения 60-дневной дачи холестерина (в дозе 200 мг/кг) приводило к более быстрой, чем в контроле (при самопроизвольном обратном развитии атеросклероза) нормализации содержания в крови холестерина, беталипопротеидов и коэффициента холестерин/фосфолипиды (табл.6). Содержание холестерина в группе опытных кроликов снизилось за время введения средства на 70,77±3,8% тогда как в контрольной группе на 55,14±3,8, р <0,02. Содержание бета-липопротеидов уменьшилось в опыте на 65,59±5,14% а в контроле на 42,10±7,3% различие существенно, р < 0,02. Коэффициент холестерин/фосфолипиды в опытной группе был ниже, чем в контроле на 39,8% (1,53±0,22 против 0,92±0,1, р <0,05). Исследование аорты и печени также выявило отчетливое влияние средства на нормализацию холестерина и бета-липопротеидов (табл.7).

В аорте кроликов опытной группы содержание холестерина было на 42,33, ниже, чем в контроле (512,66±79 мг% против 889,03%±54,2 мг% р < 0,01) и существенно не отличалось от его содержания у интактных кроликов (409,31±36,1 мг% р <0,05).

Количество бета-липопротеидов аорты в опыте было меньше, чем в контроле на 39,45% (865,63±68,4 мг% р<0,02) и приближалось к уровню у интактных животных (717,52±28,4 мг% р <0,05).

Содержание холестерина в печени в опытной группе в 1,6 раза оказалось меньше, чем в контрольной (602,8±71 мг% против 973,4±84 мг% p< 0,01). Однако не вернулось к уровню интактных кроликов (310,5 ± 19,1 мг% р <0,01).

Полученные результаты свидетельствуют о выраженной способности средства ускорять нормализацию показателей липидного обмена при обратном развитии экспериментального атеросклероза.

Изучение противоаллергического действия средства проводили на модели реакции пассивной кожной анафилаксии у крыс (РПКА), опосредованной антителами класса IgЕ, которая является одним из наиболее часто используемых методов для оценки антиаллергической активности соединений.

Средство вводили животным в желудок специальным зондом в виде суспензии (с добавлением 1-2 капель твина-80) в дозе 10 мг/кг в течение 24 дней. В качестве объекта сравнения использовали противоаллергический препарат диазолин, который вводили тем же способом в дозе 10 мг/кг. Контрольным крысам в желудок вводили по 1 мл растворителя (дист. вода) с добавлением 1-2 капель твина-80. Процент ингибирования реакции вычисляли по формуле: А(100 C˙100)/В, где А процент ингибирования РПКА, С мкг синего Эванса в участках кожи крыс, получавших средство, В мкг синего Эванса в участках кожи контрольных крыс.

Результаты опытов статистически обработаны и приведены в табл.1.

Таким образом, в эксперименте установлено выраженное противоаллергическое действие средства при его курсовом введении в дозе 10 мг/кг, проявляющееся в угнетении реакции гиперчувствительности немедленного типа у животных. Активность средства на данной патологической модели превышает таковую противоаллергического препарата диазолина почти в 2 раза.

Учитывая имеющееся разрешение фармакологического комитета Минздрава СССР на апробацию средства на соответствующей категории больных в клинических условиях (протокол N 12 МЗ СССР от 24.6.88) и с учетом вновь выявленных противоаллергических свойств средства в экспериментальных условиях, сочли необходимым проведение дальнейших исследований средства у больных с иммуно- патологическими синдромами.

Все больные были разделены на 3 группы: 1 группа состояла из 36 человек, получавших средство; 2 группа (контрольная) состояла из 18 человек, получавших известный апробированный иммуномодулятор нуклеиновокислый натрий (10); 3 группа (контрольная) состояла из 18 человек, получавших плацебо. В первую группу входили: 12 больных хроническим обструктивным бронхитом, 12 больных атопическим дерматитом. Во вторую группу входили: 6 больных хроническим обструктивным бронхитом, 6 больных псориазом, 6 больных атопическим дерматитом.

Средство (0,25 г) и нуклеинат натрия (0,3 г) больные принимали по 1 таблетке 3 раза в день в течение 20 дней. Таблетки плацебо больные контрольной группы получали по такой же схеме.

Иммунологическое обследование больных всех групп проводили до и после соответствующего курса лечения. Для оценки иммунного статуса применяли тесты I и II уровней иммунологического скрининга. Выделение лимфоцитов (мононуклеарных клеток) проводилось путем центрифугирования крови в градиенте плотности фиколла верографина (d 1,077). Определяли: число лейкоцитов (тыс/мкл), абсолютное число лимфоцитов и процент по отношению к числу лейкоцитов, абсолютное и относительное количество Е- и Е_м-розеткообразующих лимфоцитов по методу Tondol, в модификации Р.В.Петрова, содержание теофилинрезистентных и теофиллинчувствительных клеток, содержание сывороточных иммуноглобулинов классов А, М, G методом радиальной иммунодиффузии в агаровом геле, а также уровень общего lgE иммуноферментным методом в тест-системах, концентрацию циркулирующих иммунных комплексов методом преципитации с 3,5% раствором полиэтиленгликоля, поглотительную способность нейтрофилов, их миелопероксидазную активность.

Статистическая обработка результатов включала определение средних величин со средней ошибкой и достоверности различий по критерию Стъюдента. Кроме того, использован метод характеристических интервалов, с помощью которых установлены границы нормы для изучаемых показателей.

Результаты исследования средства и нуклеината натрия у больных хроническим обструктивным бронхитом представлены в табл.2.

Сравнение средних величин иммунологических показателей до и после лечения при использовании исследуемых препаратов показало, что после лечения с применением средства наблюдалось повышение исходно сниженных показателей относительного и абсолютного количества Т-лимфоцитов соответственно, с 45,3±3,7% до 58,1 ± 3,1% (р < 0,01 и с 0,76 ±0,18˙10⁹/л до 1,4 ± 0,21˙10 ⁹/л (р <0,05). Характерно также снижение уровня IgM c 1,3± 0,15 г/л до 0,97± 0,12 г/л (р<0,05 и нарастание содержания IgG в сыворотке крови с 8,0± ± 0,83 г/л до 15,0± 1,95 г/л (р<0,01).

При анализе средних иммунологических показателей в группе больных, получавших нуклеиновокислый натрий, установлено преимущественное влияние средства на абсолютное и относительное количество В-лимфоцитов, которые повышались с 7,2± 1,4% до 11,2± 2,2% (р <0,01) и с 0,11± 0,01˙10⁹/л до 0,16±0,012˙10⁹/л (р<0,05), а также на фагоцитарную активность нейтрофилов, которая повысилась с 20,6±0,9% до 24,4±1,4% (р < 0,05). У больных контрольной группы, получавших плацебо, достоверных изменений средних величин иммунологических параметров не установлено.

Анализ результатов с учетом уровня исходных показателей (сниженные, повышенные, нормальные) выявил выраженное иммунолодулирующее действие средства и нуклеината натрия. В то же время, отмечено более выраженное влияние средства на клеточный иммунитет, а также более отчетливое переключение синтеза иммуноглобулинов с М на G, что свидетельствует о нормализации кооперации между иммунокомпетентными клетками.

Результаты исследования средства и нуклеината натрия у больных псориазом представлены в табл.10.

При оценке иммунного статуса у больных псориазом отмечено преимущественное поражение клеточного звена иммунитета, которое заключалось в уменьшении общего количества Т-лимфоцитов, дисбалансе субпопуляций Т-клеток. Сравнение средних величин иммунологчесих показателей до и после лечения в трех группах показало, что после лечения средством наблюдалось повышение исходно сниженного содержания Т-лимфоцитов, как относительного с 44,6±3,1% до 59,3±5,2% (Р<0,05), так и абсолютного с 0,81±0,09˙10⁹/л до 1,32±0,1˙10⁹/л, (р<0,05), а также снижение исходного повышенного уровня IgG в сыворотке крови с 21,4±3,2 г/л до 13,9±2,1 г/л (р <0,05). Использование методов характеристических интервалов позволило установить высокую эффективность средства и нуклеината натрия, оказывающих иммуномодулирующее действие и нормализующих многих нарушенные звенья иммунитета путем повышения сниженных и снижения повышенных показателей. В то же время следует отметить некоторые различия в действии двух препаратов. Так, средство оказывает более выраженное действие на Т-звено иммунитета, которое заключается в нормализации общего количества Т-лимфоцитов, а также их субпопуляций. Следует отметить снижение исходно повышенных уровня I и содержания циркулирующих иммунных комплексов.

Результаты исследования средства и нуклеината натрия у больных атопическим дерматитом представлены в табл.II.

При оценке иммунного статуса у больных атопическим дерматитом установлено достоверное повышение уровней общего IgE и IgM на фоне снижения уровня сывороточного IgА и поглотительной способности нейтрофилов. Анализ средних показателей у больных, получавших средство, выявил достоверное снижение уровня общего IgE с 388,9± 89,2 МЕ/мл до 124,3± 44,6 МЕ/мл (р <0,01), повышение фагоцитарной активности нейтрофилов с 17,4± 1,03% до 22,8 ± ± 0,87 (р <0,01) и фагоцитарного числа с 1,68± 0,08 до 1,92± 0,07 (р <0,01). Использование метода характеристических интервалов дало возможность установить характер действия изучаемого средства на иммунологические показатели в зависимости от уровня исходных показателей и в сопоставлении с группами больных, получавших нуклеиновокислый натрий и плацебо.

Из таблицы 11 видно, что нуклеиновоислый натрий оказывает более выраженное влияние на исходно сниженные показатели поглотительной способности нейтрофилов, повышая фагоцитарную активность на 39,6% а фагоцитарное число на 34,1% У больных, получавших средство, эти показатели повысились соответственно на 18,2% и 32,9% В то же время у средства выявлено отчетливое противоаллергическое действие, что подтверждается выраженным снижением уровня общего IgE у 82% больных. При лечении нуклеанатом натрия данный эффект отсутствовал.

У всех больных, получавших иммунокоррегирующую терапию, нормализация иммунного статуса сопровождалась позитивным клиническим эффектом. Так, у больных с хроническим обструктивным бронхитом, получавших средство, положительный эффект зарегистрирован у 83,3% больных (у 6 хороший, у 4 удовлетворительный, у 2 неудовлетворительный), получавших нуклеиновокислый натрий 66,7% ) у 2 хороший, у 2 удовлетворительный, у 2 неудовлетворительный), получавших плацебо у 16,6% (у 1 удовлетворительный, у 5 неудовлетворительный). У больных псориазом под влиянием средства положительный эффект наблюдался у 75% больных (у 3 хороший, у 6 удовлетворительный, у 3 неудовлетворительный), под влиянием нуклеиновокислого натрия у 66,7%), у 2 хороший, у 2 удовлетворительный, у 2 неудовлетворительный), под влиянием плацебо у всех больных клинический эффект отсутствовал. У больных атопическим дерматитом лечение средством дало положительные результаты у 91,7% больных (у 6 хорошие, у 5 удовлетворительные, у 1 неудовлетворительные), нуклеинатом натрия у 50% больных (у I хорошие, у 2 удовлетворительные, у 3 неудовлетворительные), плацебо у всех больных клинический эффект отсутствовал.

Таким образом, проведенные исследования и сравнительный анализ действия средства с известным иммуномодулирующим препаратом нуклеинатом натрия позволяют сделать вывод о более выраженном нормализующем влиянии средства на многие нарушенные звенья иммунной системы, что проявляется в регуляции Т-системы, активации фагоцитарного звена, снижении высокого уровня общего IgЕ. Средство одновременно обладает иммуномодулирующими и противоаллергическими свойствами, повышая сниженные и снижая повышенные показатели иммунитета у больных хроническим обструктивным бронхитом, псориазом, атопическим дерматитом. Способность средства при курсовом введении у больных значительно снижать уровень общего IgE позволяет рекомендовать его для патогенетической терапии аллергических заболеваний. Нормализация иммунного статуса под влиянием средства проявляется в виде выраженного клинического эффекта, что позволяет рекомендовать его в комплексной терапии заболеваний, сопровождающихся иммунопатологическими синдромами (аутоиммунным, аллергическим, иммунодефицитным).

Таким образом, полученное по заявляемому способу средство обладает выраженным противоатеросклеротическим, антиметогенным, кардиотоническим, антиаллергическим и иммуномодулирующим действием.

Использование: изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической активности и касается способа получения фитосредства, обладающего одновременно пятью активностями: а именно противосклеротическим, антимитогенным, кардиотоническим, антиаллергическим и иммуномодулирующим действием. Сущность способа заключается в экстракции отходов производства экстракта чабреца, шрота после экстракции травы 30% этиловым спиртом, 96% этанолом методом реперколяции в батарее из четырех перколяторов с последующим осаждением целевого продукта водой, отделении осадка и его высушивании. Технический результат заключается в разработке комплексного препарата, обладающего одновременно пятью активностями на уровне современных химико-терапевтических препаратов. 11 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОАТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИМ, АНТИЛИТОГЕННЫМ, КАРДИОТОНИЧЕСКИМ, АНТИАЛЛЕРГИЧЕСКИМ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ, путем экстракции шрота чабреца, полученного после экстракции травы чабреца 30%-ным этиловым спиртом, 96%-ным этиловым спиртом методом реперколяции в батарее из четырех перколяторов с последующим осаждением целевого продукта водой, отделением осадка и его высушиванием.