СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА СВИНЕЙ Российский патент 1995 года по МПК A61B10/00 A61B10/00 G01N33/48 

Изобретение относится к биологии и ветеринарии, может быть использовано для анализа неспецифической резистентности организма у животных с иммунодефицитными состояниями.

Нейтрофилы крови являются важнейшими клетками-эффекторами, определяющими уровень неспецифической антиинфекционной резистентности организма, поскольку на них замыкается ряд важнейших плазменных систем (естественные антитела, комплемент, калликреин-кининовая система, продукты метаболизма арахидоновых кислот и др.), которые необычайно чувствительны к изменению гомеостаза в условиях патологии. Недостаточность функций нейтрофилов закономерно реализуется в виде воспалительных поражений внутренних органов инфекционного генеза. Исходя из этого, исследование фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) в цельной крови по праву считается одним из наиболее ценных показателей, отражающих уровень неспецифической резистентности организма.

Прототипом изобретения является метод исследования ФАН в цельной крови [2] При осуществлении данного способа к крови добавляют объекты фагоцитоза (ОФ), инкубируют в термостате при 37^оС в условиях периодического перемешивания реагирующих компонентов, готовят мазок, окрашивают по Романовскому, микроскопически определяют количество ОФ, заключенных в нейтрофилы. Однако при добавлении в кровь чужеродных корпускул за них конкурируют не только фагоциты крови и плазменные агенты, но и такие клеточные факторы крови, как эритроциты. Известно, что при добавлении к препаратам лейкоконцентратов аутологичных эритроцитов существенно снижается фагоцитарная активность нейтрофилов. Данная закономерность объясняется тем, что эритроциты фиксируют ОФ на своей поверхности. Способность эритроцитов фиксировать микробные корпускулы называют бактериофиксирующей активностью эритроцитов. Фиксация микробов осуществляется через гидрофобные взаимодействия, через рецепторы к СЗ в компоненту комплемента и через F с фрагмент JgI. При этом эритроцит экранирует локусы ОФ, которые обычно воспринимаются фагоцитами. В связи с этим при определении ФАН в цельной крови, когда осуществляют постоянное или периодическое перемешивание реагирующих компонентов, ОФ одинаково доступны и для фагоцитов и для эритроцитов. В этих условиях высокий уровень ФАН может быть обусловлен не только высокой функциональной активностью нейтрофилов, но и низкой бактериофиксирующей активностью эритроцитов. Низкий уровень ФАН не всегда признак недостаточности фагоцитарного процесса, так как он может быть обусловлен высоким уровнем бактериофиксирующей активности эритроцитов. В связи с этим метод исследования фагоцитоза в цельной крови при условии постоянного перемешивания реагирующей смеси позволяет получить показатель, который является результатом взаимодействия клеточных и плазменных компонентов крови с ОФ. В условиях патологии эти взаимоотношения могут складываться неоднозначно, что снижает точность определения неспецифической резистентности организма при использовании прототипа.

Сущность изобретения оценка неспецифической резистентности организма в условиях патологии для проведения своевременных профилактических и лечебных мероприятий. Это достигается тем, что определяют соотношение ФАН₁/ФАН₂, где ФАН₁ уровень фагоцитарной активности нейтрофилов после перемешивания крови на предметном стекле, инкубации при 37^оС во влажной камере, наслоения суспензии ОФ на плазменный слой, содержащий фагоциты, перемешивание крови и ОФ производят после повторной инкубации указанных компонентов во влажной камере и приготовления мазка крови, а ФАН₂ уровень фагоцитоза, определяемый в мазках крови, после помещения крови и ОФ в пробирку, инкубации при 37^оС в условиях перемешивания, приготовления мазка крови.

Для выполнения предлагаемого способа кровь от обследуемых помещают в пробирки с силиконированной внутренней поверхностью, стабилизируют гепарином (50 ед/мл), до исследования хранят при 4^оС не более 2 ч. В качестве ОФ используют антигенный эритроцитарный диагностикум к шиггелам Зонне (предприятие по производству бактерийных препаратов Ленинградского научно-исследовательского института вакцин и сывороток). Для приготовления суспензии ОФ ампулу сухого диагностикума растворяют в 10 мл раствора Хенкса и дважды отмывают в таком же объеме путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 3-5 мин. Центрифугат ресуспендируют в 1 мл культуральной среды, помещают в термостат на 20 мин при 37^оС для осаждения коагулировавших ОФ, берут 0,7 мл надосадочной жидкости и доводят концентрацию антигенных корпускул до 200 тыс в 1 мкл.

Для определения ФАН₁ 5 мкл крови помещают на предметное стекло, куда для создания оптимальных условий предварительно наносят такое же количество культуральной среды. Инкубируют 30 мин при 37^оС во влажной камере для разделения крови на слой плазмы, содержащий нейтрофилы, и слой нейтрофилов, лежащий на эритроцитах. На верхний слой наслаивают 5 мкл суспензии ОФ. Инкубируют во влажной камере 10 мин, осторожно перемешивают смесь с помощью шлифовального стекла, готовят мазки, фиксируют в метаноле, окрашивают по Романовскому.

При осуществлении определения ФАН₁ создают условия, когда эритроциты не препятствуют реализации фагоцитарных функций нейтрофилов, поскольку добавление суспензии ОФ осуществляют на образец крови, разделенный на плазменный слой, содержащий фагоциты, и лейкоцитарный слой, расположенный на эритроцитах.

Влажную камеру воссоздают в чашке Петри, для этого в нее помещают диск фильтровальной бумаги, размер которого равен площади чашки, наливают 2 мл дистиллированной воды. Влажные камеры прогревают 1 ч при 37^оС, стекла и культуральную среду 30 мин при той же температуре.

Определение ФАН₂ осуществляют в мазках крови, окрашенных по Романскому. Кровь и суспензию ОФ (200 тыс в 1 мкл) смешивают в пробирках однократного применения (Ленинградский завод медицинских полимеров) в соотношении 1:1. Инкубируют при 37^оС в течение 10 мин в условиях перемешивания реагирующих компонентов. На предметное стекло переносят 15 мкл смеси, готовят мазок и определяют количество ОФ, поглощенных нейтрофилами. В данной модели взаимодействия крови и ОФ создают условия для контакта с чужеродными корпускулами не только фагоцитов, но и эритроцитов.

Интенсивность фагоцитоза выражают в виде фагоцитарного числа (ФЧ) и процента фагоцитоза (%Ф). Фагоцитарное число это среднее количество объектов фагоцитоза, приходящееся на 1 из 100 учтенных нейтрофилов. Процент фагоцитоза это количество нейтрофилов, поглотивших ОФ, на 100 учтенных нейтрофилов. На заключительном этапе осуществления метода определяют соотношение ФАН₁/ФАН₂. Уменьшение этого показателя ниже доверительного интервала контрольной группы свидетельствует о снижении неспецифической резистентности организма.

П р и м е р. Определение ФАН₁/ФАН₂ у свиней с недостаточностью фагоцитоза.

Исследование выполнено на кафедре патологической физиологии филиала Пермского государственного медицинского института в г. Кирове и в совхозе "Заречье" управления торговли Кировского облисполкома. ФАН₁/ФАН₂ определяли у свиней с иммунодефицитным состоянием, характеризующимся снижением поглотительной и бактерицидной активности нейтрофилов крови, а также воспалительным поражением легких. ФАН₁/ФАН₂ изучили также у свиней без нарушения фагоцитарного процесса, которые составили контрольную группу. Недостаточность фагоцитоза у свиней получали при введении в корм пищеотходов многодневного сбора. Снижение показателей, отражающих фагоцитарную и бактерицидную активность нейтрофилов периферической крови, выявляли через 3-4 недели после назначения в корм выше указанного компонента. Снижение функциональной активности нейтрофилов закономерно сочеталось с воспалительным поражением легочной ткани, что является важнейшим клиническим признаком снижения неспецифической резистентности организма.

Определение ФАН₁ и ФАН₂ производили по способу, описанному в данной работе. Результаты исследования представлены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1, у животных с недостаточностью фагоцитоза, которая клинически реализуется в виде пневмоний, выявлено существенное снижение ФАН₁/ФАН₂ в сравнении с контрольной группой. Достоверное снижение этого показателя выявлено как при расчете, основанном на определении фагоцитарного числа, так и основанном на определении процента фагоцитоза. Важно отметить, что при определении Ф, снижение ФАН₁/ФАН₂ выявлено у всех животных с воспалительным поражением легочной ткани (100%), поскольку во всех случаях он был меньше нижней границы доверительного интервала контрольной группы (0,80-1,06). При расчете ФАН₁/ФАН₂, основанном на определении фагоцитарного числа, снижение неспецифической резистентности отмечено у меньшего числа животных подопытной группы (83%).

В табл. 2 представлены индивидуальные показатели ФАН₁ и ФАН₂, а также соотношение этих величин ФАН₁/ФАН₂. Поскольку более информативным оказалось соотношение ФАН₁/ФАН₂, рассчитанное на основе определения Ф, в табл. 2 приведены именно эти величины.

Как видно из данных табл. 2, у животных подопытной группы, у которых недостаточность функциональной активности нейтрофилов крови сочетается с пневмониями, величины, отражающие неспецифическую резистентность организма (ФАН₁/ФАН₂), существенно ниже показателей контрольной группы. Только у 2 животных с иммунодефицитным состоянием соотношение уровней фагоцитарной активности нейтрофилов равно самому низкому показателю в контрольной группе.

Приведенные в данной работе материалы, основанные на анализе средних показателей (табл. 2), свидетельствуют о возможности выявления снижения неспецифической резистентности организма при использовании предлагаемого способа.

Проведенное исследование позволяет заключить, что способ определения неспецифической резистентности организма прост в исполнении, поскольку в ходе его выполнения готовят всего два мазка для определения ФАН₁ и ФАН₂. Данный способ обладает высокой точностью, достаточной для выявления снижения неспецифической резистентности при иммунодефицитных состояниях, в основе которых лежит нарушение фагоцитарной функции клеток крови. Высокая чувствительность предлагаемого способа определяет возможность экстренных иммунокоррегирующих мероприятий направленных на предотвращение формирования и углубления воспалительных заболеваний внутренних органов инфекционного генеза.

Изобретение может быть использовано в лабораториях ветеринарного профиля для анализа антимикробной устойчивости организма при иммунодефицитных состояниях, характеризующихся нарушением функциональной активности фагоцитов крови.

Использование: в биологии и ветеринарии, в частности в способах анализа неспецифической резистентности организма животных с иммунодефицитными состояниями. Сущность изобретения: способ определения неспецифической резистентности организма животных основан на методе исследования соотношения показателей фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) в двух мазках крови, ФАН₁/ФАН₂, где ФАН₁ отражает уровень фагоцитоза, определяемый после помещения крови на предметное стекло, инкубации при 37°С во влажной камере, наслоения взвеси объектов фагоцитоза на плазменный слой, содержащий нейтрофилы, перемешивания реагирующих компонентов после повторной инкубации, приготовления мазка, а ФАН₂ отражает уровень фагоцитоза, определяемый после помещения крови и взвеси объектов фагоцитоза в пробирку, инкубации при 37°С в условиях периодического встряхивания с последующим приготовлением мазка. Способ испытан у свиней с недостаточностью фагоцитарной активности, которое сочеталось с воспалительными процессами во внутренних органах. 2 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА СВИНЕЙ, включающий исследование фагоцитарной активности нейтрофилов крови (ФАН), отличающийся тем, что исследуют соотношение ФАН₁/ФАН₂, где ФАН₁ уровень фагоцитарной активности нейтрофилов, определяемый в мазках крови после ее помещения на предметное стекло, инкубации при 37^oС во влажной камере, наслоения взвеси объектов фагоцитоза на плазменный слой, содержащий нейтрофилы, перемешивания реагирующих компонентов после повторной инкубации, приготовления мазка, а ФАН₂ уровень фагоцитоза, определяемый в мазках крови после помещения крови и взвеси объектов фагоцитоза в пробирку, инкубации при 37^oС в условиях периодического встряхивания с последующим приготовлением мазка, причем уменьшение соотношения ФАН₁/ФАН₂ у свиней ниже 0,80 свидетельствует о снижении неспецифической резистентности организма.