СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ФАГОЦИТОЗА В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для анализа поглотительной активности фагоцитов в цельной крови у здоровых лиц и для выявления людей и животных с недостаточностью фагоцитоза.

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов в мазках крови остается одним из самых распространенных и простых методов оценки антимикробной резистентности организма. Существует мнение о возможности доведения ошибки этого теста (коэффициент вариации в параллельных исследованиях) до 6,5% Эти данные несомненно свидетельствуют о его достаточной воспроизводимости, о возможности его дальнейшего совершенствования и возможности широкого использования для выявления недостаточности поглотительной функции нейтрофилов.

Прототипом изобретения является способ определения фагоцитарной активности лейкоцитов в цельной крови. При постановке этого метода кровь и объекты фагоцитоза (ОФ) инкубируют в пробирке в условиях периодического встряхивания. Каплю смеси переносят на предметное стекло, готовят мазок, фиксируют, окрашивают по Романовскому, микроскопически определяют количество ОФ, заключенных в нейтрофилы крови. Однако при взаимодействии крови и ОФ в пробирке существует возможность прилипания наиболее активных фагоцитов к стеклу, поэтому в дальнейшем их поглотительную активность не учитывают. Силиконирование поверхности стекла, которое обычно используют для предотвращения прилипания фагоцитов к стеклу, не отменяет этот процесс. При постановке известного способа осуществляют встряхивание реагирующих компонентов для равномерного распределения ОФ между клетками крови и ее плазменной частью. Однако известно, что до 75% микробных корпускул, внесенных в кровь, фиксируется эритроцитами. Эритроциты экранируют антигенные сайты ОФ, уменьшают их доступность для фагоцитов крови, поэтому уровни фагоцитоза существенно снижаются при добавлении к лейкоконцентратам аутологичных эритроцитов. Представленные недостатки прототипа приводят к снижению информативности, чувствительности и точности микроскопического определения поглотительной активности фагоцитов в цельной крови.

Целью изобретения является увеличение чувствительности и точности определения фагоцитоза в цельной крови.

Это достигается тем, что каплю крови обследуемого помещают на поверхность предметного стекла, инкубируют во влажной камере для разделения крови на верхний плазменный слой, содержащий лейкоциты, и лейкоцитарный слой, лежащий на эритроцитах. После этого наслаивают суспензию ОФ, инкубируют во влажной камере, перемешивание крови и ОФ осуществляют перед приготовлением мазка, который готовят на этом же стекле, фиксируют в метаноле, окрашивают по Романовскому и микроскопически определяют ОФ, поглощенные нейтрофилами крови.

Исследование выполнено на кафедре патологической физиологии Пермского медицинского института в г.Перми и на той же кафедре филиала Пермского медицинского института в г.Кирове. Обследовано 12 здоровых доноров-людей, 34 больных с воспалительными заболевания системы мочеотделения, 10 больных с урологическими заболеваниями, осложненными хронической почечной недостаточностью (ХПН). 30 свиней (18 животных контрольная группа, 12 животных с воспалительными заболеваниями легких).

Для выполнения предлагаемого способа кровь от обследуемых помещают в пробирки однократного применения или в стеклянные пробирки с силиконированной внутренней поверхностью, стабилизируют гепарином (20-50 ед/мл), до исследования хранят при температуре 4^оС не более 2 часов. В качестве ОФ используют корпускулярный антигенный эритроцитарный диагностикум к шигеллам Зонне (предприятие по производству бактерийных препаратов Ленинградского научно-ис- следовательского института вакцин и сывороток). Для приготовления суспензии ОФ ампулу сухого антигенного эритроцитарного диагностикума растворяют в 10 мл среды 199 или раствора Хенкса и дважды отмывают в 10 мл среды путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 3-5 мин. Центрифугат ресуспендируют в 1 мл культуральной среды, для осаждения коагулировавших ОФ помещают в термостат на 20 мин при 37^оС, берут 0,7 мл надосадочной жидкости и доводят концентрацию антигенных корпускул до 50-200 тыс. в 1 мкл.

Пять микролитров крови помещают на предметное стекло, куда для создания оптимальных условий предварительно наносят такое же количество культуральной среды. Инкубируют 30 мин при 37^оС во влажной камере для разделения крови на слой плазмы, содержащий лейкоциты, и слой лейкоцитов, лежащий на эритроцитах. Наслаивают 5 мкл суспензии ОФ. Инкубируют во влажной камере при 37^оС в течение 10-20 мин, с помощью шлифовального стекла осторожно перемешивают смесь и готовят мазки, фиксируют в метаноле и окрашивают по Романовскому.

Для получения влажной камеры в чашку Петри помещают диск из фильтровальной бумаги размером, равным площади чашки, наливают 2 мл дистиллированной воды. Влажные камеры прогревают 1 ч при 37^оС, стекла и культуральную среду 30 мин при 37^оС.

Новизна заявляемого способа состоит в том, что исследуемую кровь помещают на предметное стекло, на котором производят все этапы постановки метода, что существенно увеличивает точность определения поглотительной функции нейтрофилов крови, поскольку отсутствует потеря наиболее "активных" фагоцитов из-за их адгезии на стенке пробирки. Наслаивание суспензии ОФ осуществляют на образец крови, разделенный на плазменный слой, содержащий фагоциты, и лейкоцитарный слой, расположенный на эритроцитах. Для нейтрофилов создаются условия для непосредственного взаимодействия с ОФ, снижается экранирующая роль эритроцитов, что также способствует увеличению точности определения поглотительной активности фагоцитов.

П р и м е р 1. Исследование влияния пола на фагоцитарную активность нейтрофилов (ФАН) цельной крови у здоровых доноров.

Исследование проведено c венозной кровью здоровых доноров (мужчин и женщин). ФАН в цельной крови определяли с помощью заявляемого способа и двух вариантов прототипа. Для осуществления общепринятого метода кровь и ОФ смешивали в пробирках однократного применения в соотношении 1:1 (прототип 1). Параллельно готовили пробу, где в пробирку предварительно добавляли 0,1 мл среды 199, а затем 0,1 мл крови испытуемого, после чего инкубировали 30 мин при 37^оС (прототип 2). В последней пробе создавали разведение крови, соответствующее заявляемому способу. Добавляли 0,1 мл суспензии ОФ. Дальнейший контакт осуществляли в течение 20 мин при 37^оС, каждые 5 мин пробирки встряхивали. После инкубации в термостате 15 мкл смеси наносили на предметное стекло, готовили мазки, фиксировали в метиловом спирте, окрашивали по Романовскому, определяли ФАН.

Уровень ФАН оценивали на основании определения фагоцитарного числа (ФЧ), процента фагоцитоза (%Ф), фагоцитарного индекса (ФИ). Фагоцитарное число это среднее количество ОФ, приходящееся на 1 из 100 учтенных нейтрофилов. Процент фагоцитоза это количество нейтрофилов, поглотивших ОФ, на 100 учтенных нейтрофилов. Фагоцитарный индекс это среднее количество ОФ, приходящееся на 1 нейтрофил, участвующий в фагоцитарном акте.

Результаты исследования представлены в табл. 1. Как видно из табл. 1, выявлены более высокие уровни ФАН у женщин по сравнению с мужчинами. Важно отметить, что эта закономерность определяется только при использовании заявляемого способа. Применение прототипа не позволяет выявить данное различие. Представленные результаты свидетельствуют о возможности выявления физиологических особенностей фагоцитарного процесса у здоровых людей с помощью заявляемого способа.

П р и м е р 2. Исследование влияния хронической почечной недостаточности и возраста на фагоцитарную активность нейтрофилов у больных с воспалительными заболеваниями системы мочеотделения.

Изучены уровни ФАН в цельной крови у больных с воспалительными заболеваниями системы мочеотделения, осложненных и неосложненных хронической почечной недостаточностью (ХПН), при использовании заявляемого способа и двух вариантов прототипа.

В табл. 2 приведены материалы исследования поглотительной активности нейтрофилов в цельной крови у больных с воспалительными заболеваниями системы мочеотделения, осложненных и неосложненных ХПН. Как видно из табл. 2, выявлено снижение фагоцитоза в цельной крови у больных с ХПН. Важно отметить, что недостаточность фагоцитарного процесса у этой группы больных удается определить только при применении заявляемого способа.

В табл. 3 представлены результаты изучения влияния возрастного фактора на фагоцитарную активность нейтрофилов у больных с урологическими заболеваниями без ХПН. Как видно из табл. 3, у больных в возрасте до 60 лет и старше не обнаружено существенных отличий фагоцитоза. Аналогичное исследование произведено с кровью больных, у которых воспалительные заболевания системы мочеоотделения были осложнены хронической почечной недостаточностью (табл. 4). Как видно из табл. 4, у этой группы больных выявлены существенно более высокие уровни фагоцитоза в возрасте до 60 лет, чем у больных более преклонного возраста. Следует отметить, что представленные выше данные о связи длительности хронической почечной недостаточности и снижения фагоцитоза удалось выявить только при использовании заявляемого способа. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ХПН сочетается с иммунодефицитным состоянием, проявляющемся в виде снижения поглотительной активности нейтрофилов в цельной крови. Степень снижения ФАН зависит от длительности заболевания, поскольку отмечается только у больных в возрасте 60 лет и старше. В этой группе больных фагоцитарный индекс у всех обследованных был ниже доверительного интервала от среднего показателя больных без хронической почечной недостаточности.

Проведенное испытание заявляемого метода определения фагоцитарной активности нейтрофилов крови свидетельствует о его большой чувствительности и точности при выявлении иммунодефицитных состояний, характеризующихся снижением поглотительной активности фагоцитов крови.

П р и м е р 3. Исследование фагоцитарной активности нейтрофилов в цельной крови у свиней с воспалительными заболевания легких.

Произведено определение фагоцитарной активности нейтрофилов в цельной крови у свиней с целью оценки неспецифической антимикробной резистентности предлагаемым (I) и общепринятым (прототип III) способами. Исследование осуществлено у здоровых свиней (контрольная группа) и свиней, подверженных воспалительным поражениям ткани легких, которые получали в корм пищеотходы многодневного сбора.

Результаты представлены в табл. 5. Как видно из табл. 5, у животных с воспалительными заболеваниями легких выявлен более низкий уровень фагоцитарной активности нейтрофилов. Отмечено, что уровни фагоцитарной активности у всех животных подопытной группы ниже доверительного интервала среднего показателя контрольной группы (100%).

Параллельно осуществили изучение фагоцитоза общепринятым способом (III второй вариант прототипа). При постановке этого теста крови и ОФ осуществляли в пробирках с инертной поверхностью в условиях периодического встряхивания реагирующих компонентов. Как видно из табл. 5, при использовании данного способа определения ФАН не обнаружено каких-либо отличий между показателями контрольной и опытной групп свиней.

Проведенное исследование позволяет заключить, что предлагаемый способ определения фагоцитоза в цельной крови обладает более высокой точностью и информативностью, достаточной для выявления иммунодефицитных состояний, в основе которых имеет место нарушение фагоцитарной функции клеток крови. Данный способ обладает большей точностью оценки неспецифической резистентности организма, в сравнении с общепринятым тестом оценки фагоцитоза.

Таким образом, заявляемый способ определения фагоцитоза в цельной крови обладает большей чувствительностью и большей точностью определения неспецифической резистентности организма. Его использование дает возможность выявить отличия ФАН у здоровых людей, связанные с физиологическими особенностями организма, например влияние пола, а также позволяет определить иммунодефицитные состояния, проявляющиеся в виде снижения поглотительной функции нейтрофилов крови (у больных с хронической почечной недостаточностью, у свиней с воспалительными поражениями ткани легких). Последнее определяет возможность экстренных иммунокорригирующих мероприятий для предотвращения формирования и углубления воспалительных заболеваний внутренних органов инфекционного происхождения.

Заявляемый способ определения фагоцитоза в цельной крови может быть использован в больничных и научно-ис- следовательских лабораториях ветеринарного профиля, для анализа физиологических особенностей фагоцитарного процесса и для выявления иммунодефицитных состояний, сопровождающихся снижением фагоцитарной активности клеток крови.

Использование: в медицине, в частности для выявления физиологических особенностей фагоцитоза. Сущность изобретения: микроколичества крови инкубируют на предметном стекле по влажной камере при температуре 37^oС для осаждения эритроцитов на стекло. На верхний слой плазмы, содержащий фагоциты, наслаивают суспензию объектов фагоцитоза, перемешивание реагирующей смеси осуществляют перед приготовлением мазка после повторной инкубации во влажной камере. Мазок готовят на том же стекле, где осуществляют взаимодействие крови и объектов фагоцитоза. После окрашивания его по Романовскому определяют объекты фагоцитоза, заключенные в фагоцитах. Способ позволяет выявлять физиологические особенности фагоцитоза у мужчин и женщин и может быть пригоден для выявления иммунодефицитных состояний, сопровождающихся снижением фагоцитарной активности нейтрофилов. 5 табл.

СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ФАГОЦИТОЗА В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ, включающий инкубацию смешанной с объектами фагоцитоза крови, приготовление мазка на предметном стекле с последующей его фиксацией, окраской и микроскопическим определением объектов фагоцитоза, заключенных в фагоциты крови, отличающийся тем, что предварительно перед инкубацией крови с объектами фагоцитоза каплю крови помещают на предметное стекло, инкубируют во влажной камере при 37^oС для разделения крови на плазменный слой, содержащий лейкоциты и лейкоцитарный слой, лежащий на эритроцитах, и наслаивают взвесь объектов фагоцитоза, а перемешивание крови с объектами фагоцитоза осуществляют перед приготовлением мазка.