СПОСОБ ОЦЕНКИ ВОСПРИИМЧИВОСТИ ОРГАНИЗМА ЖИВОТНОГО К ТУБЕРКУЛЕЗУ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано при оценке устойчивых и восприимчивых к туберкулезу лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Известен способ определения неспецифической резистентности организма свиней (патент РФ №2038820, кл. МПК А 61 В 10/00, опуб. 09.07.95 г.), основанный на исследовании соотношений показателей фагоцитарной активности нейтрофилов в двух мазках крови. Первый отражает уровень фагоцитоза, определяемый после помещения крови на предметное стекло, второй - после помещения крови и взвеси объектов фагоцитоза в пробирку. Уменьшение соотношения показателей свидетельствует о снижении неспецифической резистентности организма.

Однако данный способ используется для выявления неспецифической резистентности больных животных с иммунодефицитными состояниями.

Известен также способ прогнозирования развития туберкулезного процесса по иммунологическим показателям (см. патент РФ №2173457, кл. МКИ G 01 N 33/48, опуб. 10.09.2001), заключающийся в исследовании нейтрофилов периферической крови, определении фагоцитарного индекса завершенности фагоцитоза, поглотительной способности, исследовании моноцитов-макрофагов периферической крови и определении Fcy-рецепторов и количества лизосом.

Однако способ предназначен только для человека и используется для прогнозирования течения инфекционного процесса у больных туберкулезом людей.

Наиболее близким к заявляемому является способ отбора крупного рогатого скота на устойчивость к туберкулезу здоровых животных (см. патент РФ №2080061, кл. МКИ А 01 К 67/02, опуб. 27.05.97). Способ основан на отборе животных по комплексу аллелей групп крови и антигенов BoLA-системы, маркирующих устойчивость. Данный метод направлен на решение задачи определения генетической устойчивости животных и позволяет отбирать для воспроизводства животных конкретной породы - крупный рогатый скот.

Однако способ длителен и сложен в исполнении, требует большого количества ингредиентов. Кроме этого, способ не позволяет определять устойчивость к туберкулезу других видов животных (свиней, овец), включая и лабораторных (морских свинок, мышей, крыс, кроликов).

Изобретение направлено на решение задачи создания способа оценки восприимчивости организма здорового животного к туберкулезу на основе изучения его иммунологических показателей крови.

Техническим результатом изобретения является быстрота и простота исполнения способа при снижении затрат и расширении области применения за счет возможности использования как для сельскохозяйственных, так и лабораторных животных.

Для решения поставленной задачи в способе оценки восприимчивости организма животного к туберкулезу, заключающемся в исследовании крови, согласно изобретению к цитратной крови животного добавляют живую культуру микобактерий в соотношении 1×10⁹ микробных клеток в 1 мл цитратной крови, готовят мазки и окрашивают их, затем определяют поглотительную способность нейтрофилов и выявляют наличие микобактерий на лимфоцитах, при наличии микобактерий на 9%-35% лимфоцитах и значении поглотительной способности нейтрофилов более 6,0 судят о восприимчивости животных к туберкулезу.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано способа оценки восприимчивости организма животного к туберкулезу, позволяющего проводить дифференциацию здоровых животных на восприимчивых и устойчивых к заболеванию туберкулезом по показателю поглотительной способности нейтрофилов и процента наличия микобактерий на лимфоцитах.

Все известные методы связаны с исследованиями уже инфицированного организма. Авторами выявлен лишь один источник информации, являющийся прототипом данного изобретения (см. патент РФ №2080061), в котором была решена задача выявления устойчивых к заражению туберкулезом здоровых животных (крупного рогатого скота). Однако он основан на определении генетической устойчивости организма.

Задачу выявления способного к заражению туберкулезом здорового организма животного на основе изучения его иммунологических показателей крови никто не ставил.

Сказанное позволяет нам сделать вывод о наличии в заявляемом способе критерия «изобретательский уровень».

Способ осуществляется следующим образом.

Осуществляют забор крови у здорового животного. В пробирку с цитратной кровью добавляют микобактерий, в частности вакцину БЦЖ в соотношении 1·10⁹ м.к. в 1 мл цитратной крови. Спустя 30 минут осуществляют приготовление мазков общепринятыми методами, в частности методом окраски по Циль-Нильсону, после чего проводят микроскопические исследования мазков. Выявляют наличие микобактерий на лимфоцитах и определяют поглотительную способность нейтрофилов. При наличии микобактерий на 9%-35% лимфоцитах и при значении поглотительной способности нейтрофилов не менее 6,0 судят о восприимчивости животных к туберкулезу.

Пример 1.

В опыте было использовано 20 белых крыс, у которых брали кровь и стабилизировали ее гепарином.

В пробирки вносили вакцину БЦЖ в количестве 0,5 мг на 1 мл цитратной крови, что соответствовало 1·10⁹ микробных клеток. Смесь выдерживали при 37°С в течение 30 минут. Готовили мазки методом окраски по Циль-Нильсону и осуществляли микроскопические исследования. Определяли значение поглотительной способности и наличие микобактерий на лимфоцитах. У одной группы животных в количестве 10 крыс значение поглотительной способности (фагоцитарный индекс) было равно 4,8±0,3, при этом микобактерий на лимфоцитах отсутствовали. У второй группы в количестве 10 крыс фагоцитарный индекс составлял 6,8±0,6 при наличии микобактерий на 11,8±2,1% лимфоцитов.

Аналогичные исследования были проведены на кроликах и морских свинках.

Результаты исследований представлены в таблице.

ТаблицаВид животногоКол-во животныхФагоцитарный индексКоличество лимфоцитов, на которых имеются микобактерий, %Иммунное состояниеКрысы104,8±0,32,1±0,1Устойчивы106,8±0,611,8±2,1ВосприимчивыКролики105,7±0,23,4±0,5Устойчивы107,9±0,917,5±1,6ВосприимчивыМорские свинки107,0±0,628,9±4,1ВосприимчивыТелята103,4±0,54,8±0,5Устойчивы109,1±0,818,6±1,6Восприимчивы

Для доказательства обоснования полученного результата было проведено контрольное заражение животных путем подкожного введения им вирулентной культуры M. bovis.

Заболевание диагностировали по клиническим признакам, а также путем проведения патологоанатомических и бактериологических исследований.

По результатам патологоанатомических исследований признаков заболевания туберкулезом у крыс с поглотительной способностью нейтрофилов 4,8±0,3 не выявлено. У крыс с поглотительной способностью нейтрофилов >6,0 (фагоцитарный индекс был равен 6,8±0,6) и наличием микобактерий на поверхности более, чем на 10% лимфоцитов (11,8±2,1) регистрировались характерные изменения во внутренних органах и была выделена культура M. bovis.

У кроликов с высоким значением поглотительной способности (фагоцитарный индекс 7,9±0,9) и наличием микобактерий на 17,5±1,6% лимфоцитах отмечались клинические признаки туберкулеза. Результаты патологоанатомических изменений подтвердили наличие характерных изменений во внутренних органах, а при проведении бактериологических исследований была выделена культура M. bovis.

Аналогичные результаты были получены и у морских свинок, значение фагоцитарного индекса которых составляло 7,0±0,6, а количество лимфоцитов с микобактериями - 28,9±4,1%.

Таким образом, заявляемый способ позволяет по показателю поглотительной способности нейтрофилов и количеству микобактерий на лимфоцитах осуществлять дифференциацию здоровых животных на устойчивых и восприимчивых к заражению туберкулезом.

Изобретение относится к ветеринарии. Для осуществления способа к нитратной крови животного добавляют живую культуру микобактерий в соотношении 1×10⁹ микробных клеток в 1 мл нитратной крови, инкубируют смесь в течение 30 минут при 37°С. Затем готовят мазки и окрашивают их, определяют поглотительную способность нейтрофилов и выявляют наличие микобактерий на лимфоцитах. При наличии микобактерий на 9-35% лимфоцитах и значении поглотительной способности нейтрофилов более 6,0 судят о восприимчивости животных к туберкулезу. Использование способа позволяет в короткие сроки с помощью простых приемов оценить устойчивость и восприимчивость к туберкулезу лабораторных и сельскохозяйственных животных. 1 табл.

Способ оценки восприимчивости организма животного к туберкулезу путем исследования крови, отличающийся тем, что к цитратной крови животного добавляют живую культуру микобактерий в соотношении 1·10⁹ микробных клеток в 1 мл цитратной крови, инкубируют смесь в течение 30 мин при 37°С, готовят мазки и окрашивают их, затем определяют поглотительную способность нейтрофилов и выявляют наличие микобактерий на лимфоцитах, при наличии микобактерий на 9-35% лимфоцитах и значении поглотительной способности нейтрофилов более 6,0 судят о восприимчивости животных к туберкулезу.