СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НАТРИЕВОЙ СОЛИ ДНК Российский патент 1995 года по МПК A61K35/56 C07H21/04 

Изобретение относится к медицине, конкретно к новому лекарственному средству, а именно к нативному, стерильному 0,1-0,8%-ному раствору натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в 0,09-0,11%-ном растворе хлористого натрия, который может найти применение в медицинской практике.

Известен способ получения низкомолекулярной ДНК (м.масса 300-500 тыс. Д), заключающийся в том, что сгустки высокополимерной ДНК отделяют от спирта, подвергают набуханию в воде, гомогенизируют и деполимеризируют ультразвуком. Определяют содержание ДНК в растворе, доводят концентрации ДНК и хлористого натрия до необходимых, фильтруют через пакет фильтров с диаметром пор 1,2; 0,65; 0,45 и 0,22 мкм и стерильно разливают во флаконы.

Недостатком известного способа является то, что растворы ДНК, полученные с его использованием, теряют прозрачность при хранении.

В результате длительных экспериментов было установлено, что потеря прозрачности связана с реполимеризацией и агрегацией ДНК в основном по имеющимся "липким" участкам молекул.

С целью устранения указанного недостатка предлагается в качестве лекарственного средства использовать нативный, стерильный 0,1-0,8%-ный раствор ДНК с молекулярной массой 280-400 тыс. Дальтон в интервале значений молекулярных масс ±30 тыс. Дальтон в 0,09-0,11%-ном растворе хлористого натрия. При выделении ДНК в узком диапазоне молекулярных масс происходит резкое уменьшение концентраций молекул с "липкими" участками, что приводит к увеличению срока хранения стерильных, нативных растворов ДНК.

Способ иллюстрирует график на чертеже.

В качестве возможных способов выделения фракции растворов ДНК в узком интервале значений молекулярных масс можно использовать ультразвуковое воздействие, причем частоту и мощность облучателя подбирают таким образом, чтобы необходимая молекулярная масса образовывалась при выходе в режим, когда она далее не уменьшается. При использовании ультразвукового генератора УЗГЗ-4М озвучивание ведут в непрерывном потоке в режиме: напряжение выхода 370 В, ток входа 12,0 А, ток подмагничивания 12,5 А, частота генерации 22 кГц до прекращения уменьшения молекулярной массы ДНК. Другим способом выделения стерильного, нативного раствора ДНК является выделение узких фракций с помощью мембранной технологии.

Ограничения молекулярной массы растворов ДНК связаны с тем, что при получении фракций с молекулярной массой ниже 200 тыс. дальтон происходит потеря нативности и в связи с этим изменяется воздействие на организм человека.

С другой стороны, длительный анализ экспериментальных лекарственных форм нативного, стерильного раствора ДНК показал, что при молекулярных массах ниже 400 тыс. дальтон не происходит потери прозрачности при хранении стерильных растворов ДНК.

Концентрация хлористого натрия подобрана таким образом, чтобы сохранялась нативность ДНК и достаточная скорость стерильной фильтрации.

Стерильные нативные растворы ДНК с молекулярной массой 280-400 тыс. дальтон в интервале ± 30 тыс. дальтон выдерживают хранение без потери пpозрачности при комнатной температуре в течение двух лет, они могут быть использованы в качестве лекарственных средств непосредственно и в качестве композиций для пролонгации лекарственного действия и/или уменьшения токсичности других лекарств. Проводится клиническое изучение препарата ДНК (в виде 0,5 и 0,25%-ного растворов) в качестве стимулятора миелопоэза и средства ускорения пpолиферации эпителия. Препарат пригоден как при парентеральном введении, так и наружном применении. Препарат проходит клиническое изучение под названием "Деринат".

Ниже приведены ускоренные данные о свойствах и характеристиках препаратов ДНК:
Молекулярная масса, тыс. дальтон 280-400 Гиперхромный эффект, 40
Содержание белка, мг/мл не более 0,09
Технический результат увеличение срока хранения с сохранением лечебных свойств препаратов ДНК.

Отличительной особенностью предлагаемого лекарственного средства является использование стерильного нативного 0,1-0,8%-ного раствора ДНК с молекулярной массой 280-400 тыс. дальтон в интервале фракционного состава, не превышающем ± 30 тыс. дальтон в 0,09-0,11%-ном растворе хлористого натрия.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является использование ультразвуковой обработки растворов ДНК в непрерывном потоке в режиме, который подбирается таким образом, чтобы получалась необходимая молекулярная масса ДНК, которая бы далее не уменьшалась. Так, при использовании генератора УЗГЗ-4М: напряжение выхода 370 В; ток входа 12,0 А; ток подмагничивания 12,5 А; частота генерации 22 кГц до прекращения уменьшения молекулярной массы ДНК.

П р и м е р ы 1-17. Исходное сырье высокомолекулярная ДНК (молекулярная масса > 10 млн. дальтон. К 80 г высокополимерной ДНК, прибавляют 10 л воды для инъекций, перемешивают в течение 2 ч, оставляют для набухания на сутки, перемешивают дополнительно 10 мин и гомогенизируют высокоскоростной мешалкой. Гомогенизированную ДНК деполимеризуют с помощью ультразвука при температуре раствора не выше 40^оС. Ультразвуковая установка состоит из генератора УЗГЗ-4М и магнитострикционного преобразователя. Режим работы генератора: частота генерации 22 кГц, ток подмагничивания 12,5 А; ток входа 12,0 А; напряжение 400 В. Озвученный раствор фильтруют. Контроль за деполимеризацией проводят на вискозометре ВПЖ-2 с диаметром капилляра 0,99 мм.

Кинетика снижения молекулярной массы ДНК приведена на чертеже. Озвучи- вание ведут до молекулярной массы 280-400 ± 30 тыс. дальтон. Озвученный раствор фильтруют последовательно через фильтровальную бумагу, мембранные фильтры с диаметром пор 1,2; 0,65-0,45; 0,22 мкм.

Раствор деполимеризованной ДНК доводят до концентрации ≈0,6% ДНК в 0,1% -ном растворе NaCl, стерилизуют фильтрацией через фильтр 0,22 мкм и разливают по флаконам.

Полученную ДНК закладывают на хранение. Результаты приведены в табл.1, где показаны результаты, полученные предлагаемым способом.

П р и м е р ы 18-23 (для сравнения).

К 80 г высокополимерной ДНК прибавляют 10 л воды, перемешивают 1-2 ч, мешалку выключают и сгусткам ДНК дают набухнуть в течение 5-24 ч. Затем включают на 5-10 мин мешалку и студнеобразную массу гомогенизируют при 8000 об/мин. Гомогенизат озвучивают на генераторе УЗГЗ-4М (ток подмагничивания 12,5 А; напряжение выхода 370 В; ток входа 12,0 А). Озвучивание ведут до получения раствора с молекулярной массой 300-500 тыс. дальтон и после стерильной фильтрации раствор ДНК разливают во флаконы. Результаты, приведенные в табл.2, получены известным способом.

Лечебная эффективность дерината при экспериментальной лучевой болезни у собак.

28 беспородных собак массой 9-20 кг подвергали тотальному воздействию γ-лучей ⁶⁰Со в дозе 3,46 г. Через 24 ч после облучения 17 собакам подкожно ввели 0,5% -ный раствор дерината из расчета 30 мг/кг массы тела. 11 собак служили контролем облучения, из которых 10 (91%) погибли от тяжелой лучевой болезни. Введение дерината снизило выраженность основных симптомов заболевания и повысило выживаемость животных до 41% (р < 0,05). Минимальный уровень лейкоцитов в крови леченых собак составил 1,0 ± 0,2 в 1 мкл, тогда как у контрольных собак этот показатель был существенно ниже 0,6 ± 0,1 (р < 0,05). Следовательно, деринат обладает лечебным действием при костно-мозговой форме лучевой болезни.

Применение дерината для лечения миелодепрессии, вызванной цитостатической терапией у онкологических больных.

У 8 больных гемобластомами и злокачественными образованиями для преодоления побочного действия противоопухо- левого лечения (лейкопения вплоть до агранулоцитоза) применено подкожное струйное введение 10-12 мл 0,5%-ного раствора дерината на фоне цитостатической терапии при снижении уровня лейкоцитов до 2 тыс. в 1 мкл крови. Установлено выраженное лейкопоэзстимулирующее действие дерината повышение количества лейкоцитов до 4 тыс. через сутки после введения с последующим дальнейшим увеличением их числа до 5-6 тыс. на 10-14 сутки. В группе больных, являющейся контролем при применении других традиционных средств, используемых для гемостимуляции (зимозан, витамины группы В, глюкокортикостероиды), эффект был выражен значительно менее увеличение количества лейкоцитов наблюдалось не более чем на 30% на 10-14 сутки от начала стимуляции.

Миелостимулирующая активность дерината.

В опытах на 10 интактных беспородных собаках и 40 мышах линии F₁ (CBA х C₅₇В1) исследовано влияние многократного введения дерината на систему кроветворения. Деринат вводили десятикратно один раз в сутки собакам подкожно в дозе 100 мк/кг, а мышам внутрибрюшинно в дозе 500 мг/кг. Клинический анализ периферической крови животных осуществляли на 1-е и 30-е сутки после окончания курса инъекций дерината. Показано достоверное увеличение содержания нейтрофильных гранулоцитов в крови собак (с 8,9 тыс. в норме до 16,8 тыс.) и мышей (с 0,7 до 1,7 тыс). У мышей повышенное содержание нейтрофильных элементов сохранялось и через 1 месяц (2,2 тыс.).

Таким образом, деринат при введении интактным животным обладает выраженным и длительным стимулирующим влиянием на миелоидный росток кровет- ворения.

Изобретение относится к медицине, конкретно к получению нового лекарственного средства, которое может найти применение в медицине. В качестве лекарственного средства предложен нативной стерильный 0,1 0,8%-ный раствор натриевой соли ДНК с молекулярной массой 280 400 тыс. дальтон в интервале фракционного состава - 30 тыс. дальтон в 0,09 0,11%-ном водном растворе хлористого натрия, который сохраняет прозрачность в течение 2 лет и способ его получения, заключающийся в том, что используют ультразвуковую обработку растворов ДНК в непрерывном потоке в режиме, обеспечивающем выход на постоянную молекулярную массу, находящуюся в указанном интервале. 2 табл, 1 ил.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НАТРИЕВОЙ СОЛИ ДНК путем фильтрации сгустков высокополимерной ДНК, перемешивания, инкубации в течение 24 ч, повторного перемешивания, гомогенизации, обработки гомогената ультразвуком, фильтрации и стерилизующей фильтрации, отличающейся тем, что обработку гомогената ультразвуком проводят в режиме непрерывного потока до достижения постоянной молекулярной массы целевого продукта 280000 400000 дальтон в виде стабильного раствора.