СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАТРИЕВОЙ СОЛИ ГЕТЕРОГЕННОЙ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (ДНК) Российский патент 2006 года по МПК A61K31/70 A61K35/60 C07H21/04 

Изобретение относится к медицине, конкретно к способу получения лекарственного средства, а именно натриевой соли гетерогенной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), которая нашла широкое применение в медицинской практике.

ДНК как биохимическая субстанция в лабораторной практике выделяется более полувека. Уже к 60-ым годам прошлого века были сформулированы основные методы и подходы к процессу выделения ["Нуклеиновые кислоты" под ред. И.Б.Збарского, М., Мир, , 1966 г.]. Практически во всех описанных к тому времени методиках процесс выделения сводился к следующим основным шагам:

1. Гомогенизация сырья и экстракция водорастворимых примесей в водных растворах при низкой ионной силе, получение исходного материала для выделения ДНК путем его осаждения на центрифуге.

2. Экстракция ДНК в присутствии детергента.

3. Удаление белков и других, растворимых в растворе детергента примесей путем создания условий, при которых они становятся плохо растворимыми (обработка фенолом, высаливание и т.д.).

4. Удаление агрегированных примесей путем центрифугирования или фильтрации.

5. Осаждение ДНК путем добавления в раствор высокой концентрации спиртов (этиловый, изопропиловый и т.д.).

Для достижения более высокой степени очистки ДНК использовалось повторение пунктов 1, 3, 4.

Разработанные подходы и методы хотя и широко использовались в лабораторной практике, имели ряд недостатков, делающих их применение в промышленных масштабах трудоемкими и дорогостоящими. Одним из главных недостатков этих методов было использование дорогостоящих центрифуг, имеющих ограниченные объемы.

Начиная с 90-х годов, ДНК начали использовать в качестве биологически активного продукта в медицине и косметической промышленности. Это наложило дополнительные специфические требования на выделяемые промышленным способом препараты. В частности, потребовались высокая степень очистки и относительно низкие молекулярные массы, то есть появилась необходимость фрагментации ДНК. Кроме того, возникла потребность в длительном хранении получаемых стерильных препаратов ДНК с сохранением их физико-химических свойств. Большинство патентов по методам выделения ДНК, зарегистрированных к настоящему времени, направлены на решение вышеуказанных проблем промышленного получения препаратов ДНК, а именно снижения себестоимости, ускорению и упрощению производства, увеличению чистоты и сроков хранения получаемых препаратов.

В частности, известен способ получения нативного стерильного 0,1-0,8%-ного раствора ДНК с молекулярной массой 280-400 кДа (килоДальтон) в интервале значений молекулярных масс ±30 кДа в 0,09-0,11%-ном растворе хлористого натрия, используемого в качестве лекарственного средства (см., патент RU №2039564, А 61 К 35/56, 20.07.1995).

Данный способ позволяет выделить препарат ДНК с относительно узким распределением молекулярных масс молекул и сократить долю молекул с "липкими" концами. Последнее требование приводит к уменьшению их агрегационной способности и к увеличению срока хранения стерильного раствора нативной неагрегированной ДНК. Однако этот способ получения достаточно сложен и длителен, так как требует использование ультразвуковой обработки и применение мембранных технологий.

Известен способ получения ДНК, в котором для ускорения процесса и устранения центрифугирования при удалении скоагулированных примесей (указанный выше пункт 4) экстракт ДНК предварительно обрабатывается ультразвуком для снижения вязкости раствора, а затем в раствор добавляются кизельгур, способствующий формированию удобного для фильтрации осадка. Эта процедура позволяет заметно увеличить скорость фильтрации (см. патент RU №2017496, А 61 К 35/60, С 07 Н 21/04 28.12.1990). Однако данный способ также требует использование достаточно медленного процесса ультразвуковой обработки и применение мембранных технологий.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения натриевой соли гетерогенной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из семенников животных и их спермы, включающий измельчение и гомогенизацию исходного сырья в растворе детергента, экстракцию ДНК при повышенной температуре, отделение жидкой фазы фильтрованием и осаждение продукта спиртом (см. патент RU №2005724, 15.01.1994).

Данный способ позволяет повысить производительность и получать более высокий выход ДНК с характеристиками, которые необходимы для существенного расширения области его применения (ограниченное снижение молекулярной массы при сохранении нативной структуры и высокое качество очистки). Однако и этот способ получения натриевой соли ДНК достаточно сложен и требует строгого соблюдения технологии его получения.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является упрощение технологии получения натриевой соли ДНК и увеличение выхода конечного продукта при сохранении его качественных характеристик.

Указанная задача решается за счет того, что способ получения натриевой соли гетерогенной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из семенников животных и/или их спермы включает измельчение и гомогенизацию исходного сырья в растворе детергента, обработку раствора при повышенной температуре с одновременным перемешиванием раствора, отделение жидкой фазы фильтрованием и осаждение продукта спиртом, при этом гомогенизацию проводят в 1-4%-ном растворе додецилсульфата натрия в дистиллированной воде при температуре 35-60°С и постоянном перемешивании раствора в течение 1,5-4 ч, после чего в раствор добавляют коагулянт - перманганат щелочного или щелочно-земельного металла до получения концентрации коагулянта в растворе 0,0005-0,03 М, полученный раствор перемешивают при температуре раствора 35-60°С в течение 25-90 мин, затем ионная сила раствора повышается до 1-3 М путем добавления в раствор соли (наиболее удобны соли соляной или серной кислоты), а раствор нагревают до 60-62°С и при указанной выше температуре перемешивают раствор 1-3 ч, далее полученный в процессе коагуляции осадок примесей отделяют фильтрованием через фильтр с порами размером от 1 до 25 мкм, отфильтрованный раствор нефрагментированной (высокомолекулярной) ДНК охлаждают до температуры 0-20°С, затем в раствор добавляют спирт до конечной концентрации 27-43,5 об%, а после этого полученный раствор перемешивают и полученный осажденный спиртом препарат отделяют фильтрованием, промывают 96%-ным этиловым спиртом и хранят под этиловым спиртом.

Кроме того, препарат с заданным молекулярным весом в диапазоне от 150 до 1 500 кДа может быть получен в виде порошка, для чего полученный, как указано выше, препарат ДНК растворяют в водном растворе NaCl концентрации 0.01-4,5 М при температуре, не превышающей 50°С, полученный раствор пропускают через гомогенизатор высокого давления при давлении до 2000 кг/см², обрабатывают полученную фрагментированную ДНК спиртом с получением концентрации спирта от 40 до 90%, причем осажденную в спирте натриевую фрагментированную ДНК отделяют центрифугированием, после чего отделенный осадок еще раз промывают спиртом и высушивают в сушильном шкафу при температуре не выше 50°С с получением порошка.

Одной из основных проблем при выделении ДНК является быстрый и дешевый способ удаления скоагулировавшего белка из экстракта ДНК (указанные выше пункты 3 и 4). Проблема усугубляется высокой вязкостью раствора на этой стадии, что усложняет как фильтрование раствора, так и его центрифугирование. Ранее в какой-то степени эта задача решалась фрагментированием ДНК на ранних стадиях процесса (снижение вязкости раствора) и/или добавлением кизельгура для формирования осадка, что позволяло увеличить скорость фильтрации. Преодолеть эту проблему и существенно увеличить скорость фильтрации на этой стадии даже без предварительной фрагментации молекул нам удалось введением в экстракт ДНК специфического коагулятора - перманганата щелочного или щелочноземельного металла при повышенной температуре с последующим увеличением ионной силы раствора. Это приводит к существенному увеличению размеров и жесткости частиц скоагулировавшего материала (денатурированный белок, детергент и другие примеси) и существенному увеличению скорости фильтрации раствора нефрагментированной ДНК практически на любых фильтрах с размерами пор менее 25 мкм. В реальном производстве этот этап выглядит следующим образом. После гомогенизации сырья и экстракции ДНК в 1-4%-ном растворе додецилсульфата натрия в дистиллированной воде при температуре 35-60°С и постоянном перемешивании раствора в течение не менее 1,5 часов в раствор добавляется перманганат щелочного или щелочноземельного металла до концентрации 0,0005-0,03 М в зависимости от используемого сырья. Процесс коагуляции продолжается 25-90 минут. Последующее повышение ионной силы раствора до 1,0-3,0 М, нагревание раствора до 60-62°С и его перемешивание в течение 1-3 ч при указанной выше температуре приводит к снижению растворимости детергента, денатурированых белков, других примесей (высаливание) и формированию из них крупных жестких частиц, которые легко могут быть удалены фильтрованием через фильтр с размерами пор от 1 до 25 мкм. Отфильтрованный прозрачный и неокрашенный раствор нефрагментированной (высокомолекулярной) ДНК охлаждают до температуры 0-20°С.

Дальнейшая задача - удалить остаточный белок, РНК и другие водорастворимые примеси. В классических способах выделения эта задача решалась в основном предварительной экстракцией водорастворимых примесей при низкой ионной силе раствора (пункт 1). В описываемом способе получения используются относительно низкие концентрации этилового спирта при осаждении ДНК. Для этого в охлажденный раствор ДНК добавляется этиловый спирт, предварительно охлажденный до 0-10°С, до концентрации 37-38 об.% с последующим перемешиванием полученного раствора. Водорастворимые примеси еще остаются растворенными при этих условиях. Выпавший в осадок препарат нефрагментированной высокомолекулярной ДНК отделяют фильтрованием и промывают этиловым спиртом.

Следующая задача - получение натриевой соли фрагментированной гетерогенной ДНК заданных размеров. Как уже указывалось, обычно для этого используется ультразвуковая обработка раствора ДНК, что является достаточно медленным и неудобным процессом. В данном изобретении для фрагментации ДНК используется процесс прохождения раствора высокомолекулярной ДНК через узкую щель при высоком перепаде давлений, например через щель гомогенизатора высокого давления. Такая процедура позволила существенно ускорить процесс. Кроме того, степень фрагментирования можно менять, меняя перепад давлений на щели и число пропусканий раствора через щель (табл.1 и 2). Для этого ДНК растворяют в водном растворе NaCl концентрации 0.01-4,5 М при температуре не выше 50°С. Полученный раствор пропускают через гомогенизатор высокого давления при давлении до 2000 кг/см², обрабатывают полученную фрагментированную ДНК спиртом с получением концентрации от 40 до 90%, осажденную в спирте натриевую соль фрагментированной ДНК отделяют центрифугированием, после чего осадок промывают 96% спиртом и высушивают в сушильном шкафу при температуре не выше 50°С с получением порошка натриевой соли фрагментированной гетерогенной ДНК.

В ходе исследования были получены следующие результаты:

Таблица 1Зависимость характеристической вязкости фрагментов ДНК и ее средней молекулярной массы от величины избыточного давления после четырех пропусканий ее раствора через щель гомогенизатора высокого давления.Избыточное давление, атм.[η]·10^-2, см³/гМолекулярная масса, кДа1258.4˜10002257.2˜8005005.0˜6009003.6˜45012001.7˜300

Таблица 2.Зависимость характеристической вязкости фрагментов ДНК и ее средней молекулярной массы от числа пропусканий ее раствора через щель гомогенизатора высокого давления при избыточном давлении 900 атм.Число пропусканий[η]·10^-2, см³/гМолекулярная масса, кДа14.8˜60024.3˜55033.9˜50043.6˜450

где [η] - характеристическая вязкость препарата ДНК.

Значения характеристической вязкости были оценены путем линейной экстраполяции зависимости приведенной вязкости раствора ДНК к нулевым концентрациям ДНК. Приведенная удельная вязкость измерялась на автоматическом ротационном вискозиметре производства СКБ биологического приборостроения РАН. Для каждой прямой были измерены не менее четырех точек с концентрациями ДНК в диапазоне от 0.1 до 3.5 мг/мл. Исходная средняя молекулярная масса молекул ДНК была не менее 7000 кДа.

Таким образом, достигнуто выполнение поставленной задачи - упрощение способа получения натриевой соли ДНК при сохранении ее характеристик.

Конкретный пример реализации способа получения натриевой соли гетерогенной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из семенников животных и их спермы:

1. Для получения ДНК берется животное сырье: молоки рыб, семенники крупного рогатого скота, сперма.

2. Сырье, например молоки рыб или семенники животных (0,5 кг), измельчают в мясорубке или любом другом гомогенизаторе.

3. Измельченная смесь переносится в емкость с мешалкой и подогревом, куда добавляется 20 л 1-3%-ного раствора додецилсульфата натрия (ДСН), предварительно подогретого до 35-60°С (температура зависит от вида сырья). Смесь постоянно перемешивают с произвольной скоростью в течение 2 ч с поддержанием вышеуказанной температуры.

4. Через 2 ч в раствор добавляют в сухом виде (или в виде концентрированного раствора) коагулянт - перманганат щелочного или щелочноземельного металла (в частности, KMnO₄). Количество коагулянта рассчитывается из необходимости получения 0,0005М - 0,03 М раствора (в зависимости от вида сырья). Для молок рыб 1-10 мМ. Вся смесь при температуре 35-60°С перемешивается 30 мин (температура зависит от вида сырья).

5. После этого ионная сила раствора повышается до 1,0-3,0 М путем добавления в раствор сухого (или в виде концентрированного раствора) хлористого натрия (возможно применение и других солей). Температура повышается до 62°С и смесь перемешивается еще 1.0-2.0 ч.

6. После этого выпадает осадок, который содержит только примеси. Осадок отделяется фильтрованием на фильтре с порами 10 мкм (керамика, бумага и т.п.).

7. После фильтрования получается прозрачный, вязкий, неокрашенный раствор, который содержит высокомолекулярную (ВМ) ДНК и незначительное количество водорастворимых примесей.

8. Раствор ВМ ДНК охлаждают до 0-20°С и добавляют заранее охлажденный спирт до концентрации 37 об % (для этилового). В случае других спиртов добавляется минимально возможная концентрация, приводящая к выпадению ДНК из раствора.

9. Натриевая соль ВМ ДНК осаждается в виде волокон, которые хорошо отделяются от раствора. Высаженный продукт отделяется фильтрованием (или другими механическими способами, например, путем наматывания на стеклянные стержни), промывается спиртом и хранится под 96% этиловом спиртом.

Получение фрагментированной (низкомолекулярной) натриевой соли ДНК из нефрагментированной (высокомолекулярной) ДНК:

1. Получение фрагментированной ДНК из ВМ ДНК любого происхождения заключается в том, что ВМ ДНК растворяется в 0,01-4,5 М водном растворе хлористого натрия при температуре, не превышающей 50°С.

2. Далее раствор пропускается через отверстие в устройстве, создающем избыточное давление, например, этим устройством может быть гомогенизатор высокого давления.

3. Одно- или многократное пропускание раствора через щелевидное или другое узкое отверстие при повышенном избыточном давлении от 1 до 2000 атм позволяет получать фрагменты ДНК заданного размера (от 150 до 1500 кДа).

4. Раствор с НМ ДНК обрабатывается спиртом (например, этиловым) с созданием спиртовой концентрации от 30 до 90%. Высаживается натриевая соль НМ ДНК, которая отделяется центрифугированием.

5. Отделенный продукт натриевой соли НМ ДНК высушивается при температуре не выше 50°С.

Сравнительные характеристики препаратов ДНК из молок осетровых, полученные с использованием различных методов, представлены в таблице 3.

Таблица 3, подтверждающая увеличение выхода конечного продукта по заявляемому методуСравнительные характеристики препаратов ДНК из молок осетровых, полученных с использованием различных методов.Параметры/
МетодВыходНедостатки метода по сравнению с предлагаемым.Содержание примесных белков (%)Средняя молекулярная масса (кДа)Гиперхромный эффект (%)Настоящая заявка5,5% ˜0,5%˜7000>М>˜300 (по желанию, в зависимости от использованного давления)-40%Патент RU №20057244,3%Медленная фильтрация экстракта. Малопродуктивная ультразвуковая обработка. Медленное концентрирование ультрафильтрацией. Необходимость отмывания целевого продукта диафильтрацией.˜1,5%400-40%Патент RU №2017496, А 61 К 35/60, С 07 21/04 28.12.1990˜1,5%450Примечание: Все выделения проводились по описанным в патентах методикам с использованием молок, принадлежащих одной партии. Количество ДНК определялось спектрофотометрически. Содержание белка определялось методом Лоури. Величина гиперхромного эффекта оценивалась по изменению оптической плотности в результате кислотной
денатурации ДНК.

Данный способ получения натриевой соли гетерогенной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из семенников животных и/или их спермы может быть использован в фармацевтической и косметической промышленности для получения современных лекарственных и косметических средств, а также в пищевой промышленности для получения пищевых добавок.

Изобретение относится к медицине, конкретно к способу получения лекарственного средства. Способ получения натриевой соли гетерогенной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из семенников животных и/или их спермы включает измельчение и гомогенизацию исходного сырья в растворе детергента, обработку раствора при повышенной температуре с одновременным перемешиванием раствора, отделение жидкой фазы фильтрованием и осаждение продукта спиртом, при этом гомогенизацию проводят в 1-4%-ном растворе додецилсульфата натрия в дистиллированной воде при температуре 35-60°С и постоянном перемешивании раствора в течение 1,5-4 ч, после чего в раствор добавляют коагулянт - перманганат щелочного или щелочно-земельного металла до получения концентрации коагулянта в растворе 0,0005-0,03 М, полученный раствор перемешивают при температуре раствора 35-60°С в течение 25-90 минут, затем ионную силу раствора повышают до 1-3 М, а раствор нагревают до 60-62°С и при указанной выше температуре перемешивают раствор 1-3 ч, далее полученный в процессе коагуляции осадок примесей отделяют фильтрованием через фильтр с порами размером от 1 до 25 мкм, отфильтрованный раствор нефрагментированной (высокомолекулярной) ДНК охлаждают до температуры 0-20°С, затем в раствор добавляют спирт до конечной концентрации 27-43,5 об%, а после этого полученный раствор перемешивают и полученный осажденный спиртом препарат отделяют фильтрованием, промывают 96%-ным этиловым спиртом и хранят под этиловым спиртом. Полученный препарат ДНК растворяют в водном растворе NaCl концентрации 0,01-4,5М при температуре, не превышающей 50°С, полученный раствор пропускают через гомогенизатор высокого давления при давлении до 2000 кг/см², обрабатывают полученную фрагментированную ДНК спиртом, причем осажденную в спирте натриевую фрагментированную ДНК отделяют центрифугированием, после чего отделенный осадок еще раз промывают спиртом и высушивают в сушильном шкафу при температуре не выше 50°С с получением порошка. В результате достигается упрощение технологии получения натриевой соли ДНК и увеличение выхода конечного продукта при сохранении его качественных характеристик. 3 табл.

Способ получения натриевой соли гетерогенной дезоксирибонуклеиновой кислоты из семенников животных и/или их спермы, включающий измельчение и гомогенизацию исходного сырья в растворе детергента, обработку раствора при повышенной температуре с одновременным перемешиванием раствора, отделение жидкой фазы фильтрованием и осаждение продукта спиртом, отличающийся тем, что гомогенизацию проводят в 1-4%-ном растворе додецилсульфата натрия в дистиллированной воде при температуре 35-60°С и постоянном перемешивании раствора в течение 1,5-4 ч, после чего в раствор добавляют коагулянт - перманганат щелочного или щелочноземельного металла до получения концентрации коагулянта в растворе 0,0005 - 0,03 М, полученный раствор перемешивают при температуре 35-60°С в течение 25-90 мин, после этого ионную силу раствора повышают до 1-3 М, а раствор нагревают до 60-62°С и при указанной выше температуре перемешивают раствор 1-3 ч, далее полученный в процессе коагуляции осадок примесей отделяют фильтрованием через фильтр с порами размером от 1 до 25 мкм, отфильтрованный раствор нефрагментированной высокомолекулярной ДНК охлаждают до температуры 0-20°С, затем в раствор добавляют спирт до конечной концентрации 27-43,5 об.%, а после этого полученный раствор перемешивают и полученный осажденный спиртом препарат отделяют фильтрованием, промывают 96%-ным этиловым спиртом и хранят под этиловым спиртом, полученный препарат ДНК в дальнейшем растворяют в водном растворе NaCl концентрации 0,01-4,5 М при температуре, не превышающей 50°С, полученный раствор пропускают через гомогенизатор высокого давления при давлении до 2000 кг/см², обрабатывают полученную фрагментированную ДНК спиртом с получением концентрации от 40 до 90%, причем осажденную в спирте натриевую фрагментированную ДНК отделяют центрифугированием, после чего отделенный осадок еще раз промывают спиртом и высушивают в сушильном шкафу при температуре не выше 50°С с получением порошка.