ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАЦИИ "ГИДРОСЕЛАТ" Российский патент 1995 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, касается создания питательной среды, которая может найти применение в медицинской и технической микробиологии, молочной промышленности, ветеринарии, а также в медицине для диагностических целей.

Известна модифицированная питательная среда (ПС) Блаурокка [1] предназначенная для выращивания бифидобактерий и содержащая, г/л: Натрий хлористый 5,0 Пептон 10,0 Лактозу 10,0 1-Цистин 0,1 Агар 0,75 Печеночный отвар до 1 л
Однако данная ПС является многокомпонентной, содержит печеночный отвар, источник сырья которого нестандартизован и является пищевым продуктом. Технология приготовления этой ПС сложна и в условиях биотехнологического производства такая среда нерентабельна.

Для выращивания лактобацилл известна питательная среда МРС-1 [2] содержащая, г/л: Пептон 10,0 Гидролизат молока 10,0 Дрожжевой экстракт 5,0 Глюкоза 20,0 Фосфорнокислый двузамещенный калий 2,0 Ацетат натрия 2,0 Цитрат аммония 2,0 Сернокислый магний 0,2 Сернокислый марганец 0,05 Твин-80 1мл Вода до 1 л
Эта питательная среда также многокомпонентна, содержит трудно поддающиеся стандартизации пищевые ингредиенты (дрожжевой экстракт, гидролизат молока), что существенно снижает воспроизводимость результатов. Недостатком ее также является сложная технология приготовления, использование дорогостоящих компонентов, дефицитных пищевых продуктов. В условиях биотехнологического производства, где требуется большое количество ПС для получения микробной биомассы, нерентабельна.

Наиболее близкой к предлагаемой по технической сущности является питательная среда для выделения бифидобактерий [3] содержащая, г/л: Ферментативный гидро- лизат мясокостного фарша тюленя 11-15 Ферментативный гидролизат печени тюленя 12-15 Лактоза 9-12 Хлористый натрий 4,5-5,5 Агар-агар 0,75-1 Дистиллированная вода до 1 л
Однако данная ПС содержит два ферментативных гидролизата, что усложняет и удорожает технологический процесс получения питательной основы. Кроме того, она предназначена только для выделения бифидобактерий при различных исследованиях, но не для накопления биомассы при промышленном получении.

Цель изобретения создание новой дешевой питательной среды для культивирования бифидобактерий и лактобацилл, не содержащей пищевых компонентов.

Для этого питательная среда для культивирования бифидобактерий и лактобацилл содержит ферментативный гидролизат селезенки млекопитающих, хлористый натрий, агар и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:
Ферментативный гидро-
лизат селезенки млеко-
питающих с конечной
концентрацией аминного азота 100-140 мг. 20,0-25,0 Хлористый натрий 4,5-5,0 Агар 0,65-0,70 Дистиллированная вода до 1 л
Для увеличения размеров колоний предпочтительно использовать модифицированную питательную среду при следующем соотношении компонентов, г/л:
Ферментативный гидро-
лизат селезенки млеко-
питающих с конечной
концентрацией аминного азота 100-140 мг. 20,0-25,0 Хлористый натрий 4,5-5,0 Агар 0,65-0,70 Пептон 14,5-15,0 Дистиллированная вода до 1 л
Отличием предлагаемой питательной среды от ближайшего аналога является использование в качестве основы питательной среды ферментативного гидролизата селезенки млекопитающих с конечной концентрацией аминного азота 100-140 мг. что упрощает процесс приготовления питательной среды, расширяет область применения предлагаемой питательной среды, так как позволяет культивировать на ней как бифидобактерии, так и лактобациллы, и создает возможность для накопления биомассы при промышленном получении.

П р и м е р 1. Получение ферментативного гидролизата.

Селезенку северного оленя (или крупного рогатого скота) промывают проточной водой, измельчают, разводят дистиллированной водой в массовом соотношении 1:1,5, добавляют 17,5 об. поджелудочной железы оленя (или крупного рогатого скота), гидролиз проводят при 38,5^оС в течение 5,5 сут в щелочной зоне рН 7,8 в присутствии 1,5 об. хлороформа. Об окончании ферментативного процесса судят по прекращению нарастания аминного азота.

Гидролиз прекращают прогреванием биомассы при 90^оС в течение 8 мин, при этом коагулируют и выпадают в осадок неразгидролизованные белки. Оставшиеся в надосадочной жидкости высокомолекулярные соединения осаждают в изоэлектрической точке белка, надосадочную жидкость фильтруют, затем подвергают высушиванию в потоке горячего воздуха в аппаратах, используемых при получении сухого молока. Режим высушивания (на входе 150-160^оС и на выходе до 95^оС) обеспечивает получение сухого препарата с остаточной влажностью не более 5,0% Полученный гидролизат имеет следующие физико-химические характеристики:
Тонко-дисперсный порошок, гигроскопичный, светло-кремового цвета с характерным запахом без гнилостного;
рН 1%-ного раствора 5,4-6,4
Растворимость не менее 5,0
Массовая доля влаги не более 5,5%
Массовая доля общего азота 10,0-11,0%
Массовая доля аминного азота 5,5-6,5%
Аминокислотный состав 1%-ного раствора, мг. изолейцин 9,0, лейцин 5,1, валин 10,3, серин 13,9, метионин 7,4, тирозин 10,4, фенилаланин 13,3, цистин 3,3, аспаргиновая кислота 16,4, глутаминовая кислота 22,3, пролин 15,0, глицин 8,5, аланин 8,7, лизин 3,4, гистидин 10,0, аргинин 6,6, триптофан 0,4.

Процесс получения указанного выше ферментативного гидролизата селезенки млекопитающих можно проводить в следующем режиме. После промывания сырья проточной водой, измельчения его и разведения дистиллированной водой в массовом соотношении 1: 1,5 добавляют 15-20 об. поджелудочной железы животного того же вида и гидролиз проводят при 37-39^оС в щелочной зоне рН 7,6-8,0 в присутствии хлороформа в течение 5-6 сут. Гидролиз прекращают прогреванием биомассы при 90^оС в течение 5-10 мин. Получают продукт, физико-химические характеристики которого и аминокислотный состав 1%-ного раствора такие же, как указано выше.

П р и м е р 2. Подобрана концентрация ферментативного гидролизата селезенки млекопитающих основы питательной среды, при концентрации хлористого натрия 4,75 г/л и агара 0,68 г/л, обеспечивающая оптимальные условия роста бифидобактерий и лактобацилл. Использованы штаммы: B. bifidum производственный N 1, 791, ЛВА-3; L. plantarum 8P-A3, L. plantarum 38, L. fermentum 39. Результаты исследования представлены в табл.1.

Как видно из данных табл.1, питательная среда на основе ферментативного гидролизата (ФГ) селезенки млекопитающих при концентрации его от 20 до 30 г/л и концентрации хлористого натрия 4,75 г/л и агара 0,68 г/л обеспечивает оптимальные условия культивирования бифидобактерий и лактобацилл.

Ростстимулирующие свойства этой среды находятся на уровне ростстимулирующих свойств известных питательных сред [1 и 2] Причем при концентрации ФГ 30 г/л рост бифидобактерий и лактобацилл аналогичен росту бифидобактерий и лактобацилл при добавлении в питательную среду ФГ, взятого в концентрации 20 и 25 г/л. При концентрации ФГ, равной 15 г/л, количество биомассы не уменьшается, однако размер колоний мельче. Следовательно, оптимальная концентрация ферментативного гидролизата селезенки млекопитающих в составе питательной среды 20,0-25,0 г/л.

П р и м е р 3. Подобраны концентрации хлористого натрия, агара и пептона в составе питательной среды на основе ФГ селезенки млекопитающих для культивирования бифидобактерий и лактобацилл. Использованы штаммы B. bifidum 791 и L. plantarum 8P-A3. Концентрации компонентов обрабатывали на шести вариантах питательных сред, представленных в табл.2 и 3.

Из полученных результатов, представленных в табл.3, видно, что питательная среда на основе ФГ селезенки млекопитающих по вариантам ПС с I по III обеспечивает оптимальные условия культивирования для бифидобактерий и лактобацилл, не отличающиеся от контроля. Добавление в эту питательную среду пептона в количествах, указанных в табл.2 (ПС по вариантам с IV по VI), увеличивает размеры колоний микроорганизмов при том же количестве биомассы.

Таким образом оптимальное соотношение компонентов в предлагаемой питательной среде для культивирования бифидобактерий и лактобацилл следующее, г/л:
ФГ селезенки млекопитающих 20,0-25,0 Хлористый натрий 4,5-5,0 Агар 0,65-0,70 Дистиллированная вода до 1 л
или
ФГ селезенки млекопитающих 20,0-25,0 Хлористый натрий 4,5-5,0 Агар 0,65-0,70 Пептон 14,5-15,0 Дистиллированная вода до 1 л
П р и м е р 4. Питательную среду готовят следующим образом. К 22,5 г ферментативного гидролизата селезенки млекопитающих добавляют 4,75 г хлористого натрия, смесь растворяют в 700 мл дистиллированной воды, затем к ней добавляют 0,68 г агара, растворенного в 200 мл воды, общий объем доводят до 1 л, тщательно перемешивают, устанавливают рН раствора 7,0-7,2 и подвергают стерилизации при 110^оС в течение 20 мин (автоклавирование). Проводят засев штаммов B. bifidum произв. N 1 и L. plantarum 8Р-А3. Данные морфологии и количество биомассы указанных микроорганизмов представлены в табл.4.

Как видно из данных табл.4, предлагаемая питательная среда обеспечивает условия культивирования бифидобактерий и лактобацилл, аналогичные известной питательной среде.

П р и м е р 5. Модифицированную питательную среду готовят следующим образом. К 22,5 г ферментативного гидролизата селезенки млекопитающих добавляют 4,75 г хлористого натрия и 14,75 г пептона, смесь растворяют в 700 мл дистиллированной воды, затем к ней добавляют 0,68 г агара, растворенного в 200 мл воды, общий объем доводят до 1 л. Смесь тщательно перемешивают, устанавливают рН раствора 7,0-7,2 и подвергают стерилизации при 110^оС в течение 20 мин (автоклавирование).

П р и м е р 6. Проведено изучение влияния предлагаемой питательной среды "Гидроселат", состав которой представлен в примере 4, на культурально-морфологические признаки производственных штаммов B. bifidum (N 1, 791, ЛВА-3). В мазках из культур, выросших в высоком столбике ПС "Гидроселат", микробы представляют собой граммположительные палочки, характерным признаком которых является раздвоение концов. Часто палочки образуют скопления, напоминающие китайские иероглифы или оленьи рога. При выращивании на ПС "Гидроселат" при 37,5-38^оС в первые сутки не обнаруживается роста, через 2-3 сут формируются колонии бифидобактерий в виде гвоздиков или комет, находящихся во взвешенном состоянии, с четким обозначением стерильной зоны. При добавлении в ПС "Гидроселат" пептона (пример 5) размер регистрируемых колоний бифидобактерий более крупный.

Изучено также влияние ПС "Гидроселат" (состав указан в примере 4) на культурально-морфологические особенности лактобацилл (L. plantarum 8Р-А3). Показано, что сохраняются типичные культурально-морфологические признаки данного штамма: граммположительные, в основном прямые, палочки с закругленными концами, расположенные беспорядочными скоплениями и отдельными короткими цепочками по 3-5. При выращивании в ПС "Гидроселат" при 37,5-38^оС в первые сутки наблюдается появление точечных колоний, через 2-3 сут организмы образуются кометообразные колонии без явного выделения стерильной зоны.

Таким образом предлагаемая питательная среда, полученная на основе ферментативного гидролизата селезенки млекопитающих, проста в приготовлении, содержит отечественные компоненты, не требует валютных вложений в оборудование для своего изготовления, обладает свойствами эталонных сред для выращивания бифидобактерий и лактобацилл, создает возможность для накопления биомассы при промышленном получении.

Использование: микробиология, основа микробиологических сред, питательная среда, "Гидроселат". Сущность изобретения заключается в том, что селезенку млекопитающих измельчают, смешивают с водой в массовом соотношении 1 1,5, подвергают гидролизу в присутствии 15 20 об. поджелудочной железы млекопитающего того же вида при 37 39°С в щелочной зоне pH 7,6 8,0 в течение 5 6 сут в присутствии хлороформа с последующим прогреванием полученной биомассы при 90°С в течение 5 10 мин, осаждением высокомолекулярных соединений в изоэлектрической точке белка, фильтрованием препарата и высушиванием. Питательная среда "Гидроселат" для культивирования микроорганизмов содержит в качестве питательной основы ферментативный гидролизат селезенки млекопитающих при следующем соотношении компонентов, г/л: ферментативный гидролизат селезенки млекопитающих с концентрацией аминного азота 100 140 мг, 20,0 25,0, хлористый натрий 4,5 5,0, агар 0,65 0,70, дистиллированная вода до 1 л. Питательная среда проста в приготовлении, содержит отечественные компоненты, обладает свойствами эталонных сред для культивирования бифидобактерий и лактобацилл. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Питательная среда для культивирования бифидобактерий и лактобацилл, содержащая питательную основу, натрий хлористый, агар и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит ферментативный гидролизат селезенки млекопитающих с конечной концентрацией аминного азота 100 140 мг/% при следующем соотношении компонентов, г/л:
Ферментативный гидролизат селезенки млекопитающих с конечной концентрацией аминного азота 100 140 мг/% 20,0 25,0
Натрий хлористый 4,5 5,0
Агар 0,65 0,70
Дистиллированная вода До 1л
2. Питательная среда по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит пептон в количестве 14,5 15,0 г/л воды.