СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА ИЗ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ЛАСТОНОГИХ И ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА "ЦЕЛАТ" ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЭУКАРИОТОВ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/00 C12N1/20 C12N5/00 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и биологической промышленности, ветеринарии и касается усовершенствованного способа получения ферментативного гидролизата, а также питательной среды на его основе, предназначенной для выращивания клеток эукариотов продуцентов биологически активных веществ, диагностических и профилактических биологических и медицинских препаратов.

Известен способ получения ферментативного гидролизата путем гидролиза в водопроводной воде измельченных органов и тканей ластоногих в присутствии ферментсодержащих органов животных того же вида при нагревании до 50^oC [1] Полученный продукт предназначен для культивирования только микроорганизмов и, соответственно, содержит высокомолекулярные полипептиды. Следовательно, он не может служить основой питательных сред для культивирования изолированных клеток человека и животных.

Известна питательная среда (ПС), полученная из продуктов ферментативного гидролиза полноценного белка молока (ГЛА), которая используется главным образом для первично-трипсинизированных культур клеток. Однако, в связи с тем, что ГЛА изготавливается фирмой ДИФКО (США) и импортируется в Российскую Федерацию, резко возрастает стоимость вирусных вакцин и других препаратов, сырьем для которых является ГЛА.

Известна также ПС 199 для культивирования различных гетероплоидных перевиваемых клеток человека и животных [2] Питательная среда 199 содержит более 60 компонентов, в том числе 20 аминокислот, 17 витаминов, коэнзимы, глюкозу, минеральные соли и некоторые другие вещества; среда полностью синтетическая. ПС 199 используется для длительного культивирования перевиваемых клеточных культур и обеспечивает высокую степень стандартности исследования. Недостатком является сложная технология ее изготовления из дорогостоящих, главным образом импортных реагентов. В условиях биотехнологического производства, где требуется большое количество питательной среды для получения клеточной биомассы, ПС 199 нерентабельна.

Задачей изобретения является упрощение технологии получения ферментативного гидролизата и снижение себестоимости конечного продукта - основы питательной среды, а также создание новой питательной среды Целат для культивирования клеток эукариотов.

Сущность изобретения заключается в том, что измельченную мышечную ткань ластоногих, смешанную с дистиллированной водой в массовом соотношении 1:2, подвергают гидролизу в присутствии 15 об. ферментсодержащих органов животных того же вида при температуре 40 42^oC в щелочной зоне рН 7,6 7,8 в течение 4 5 суток в присутствии хлороформа (1 1,5 об.), с последующим прогреванием биомассы при температуре 80 90^oC в течение 5 10 минут, осаждением высокомолекулярных соединений 20 22%-ным раствором хлористого кальция, затем в изоэлектрической точке белка, фильтрованием препарата и высушиванием.

В качестве сырья для получения ферментативного гидролизата используют непищевой белоксодержащий продукт зверобойного промысла.

Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда "Целат для" культивирования клеток эукариотов содержит ферментативный гидролизат (ФГ) мышечной ткани ластоногих при следующем соотношении компонентов (об.):
ФГ мышечной ткани ластоногих 0,15 0,20
Сыворотка крови КРС 5 10
Раствор Хенкса Остальное
Полученный описываемым способом ферментативный гидролизат мышечной ткани ластоногих дешевый полноценный продукт, не требующий для своего изготовления дорогостоящего оборудования, а ПС на его основеобеспечивает в достаточной степени стандартные условия культивирования клеток эукариотов.

Пример 1. Получение ферментативного гидролизата.

Измельченную мышечную ткань ластоногих (например, нерпы), разведенную дистиллированной водой в массовом соотношении 1:2, подвергают гидролизу ферментсодержащими органами животных того же вида, взятыми в количестве 15 об. Процесс ведут при температуре 40^oC в щелочной зоне рН 7,6 в течение 5 суток в присутствии 1,0 1,5 об. хлороформа. Гидролиз прекращают прогреванием при температуре 80^oC в течение 10 минут. Осадок удаляют центрифугированием. Оставшиеся в надосадочной жидкости высокомолекулярные соединения осаждают сначала в присутствии 20%-ного раствора хлористого кальция, а затем в изоэлектрической точке белка. Надосадочную жидкость фильтруют и подвергают высушиванию в потоке горячего воздуха методом распыления.

Полученный ферментативный гидролизат мышечной ткани ластоногих имеет следующие физико-химические характеристики:
Концентрация водородных ионов 1%-ного раствора 6,8 7,2
Растворимость, не менее 5,0
Массовая доля влаги, не более 4,0 5,0
Массовая доля общего азота, в пределах 10,0 11,0
Массовая доля аминного азота, в пределах 5,5 6,0
Содержание аминокислот в 1%-ном растворе (мг):
Изолейцин 19,5±0,05
Лейцин 43,5±0,09
Валин 22,0±0,04
Треонин 18,0±0,05
Серин 17,5±0,08
Метионин 14,3±0,07
Тирозин 21,0±0,1
Фенилаланин 24,5±0,1
Цистин 10,5±0,05
Аспарагиновая кислота 19,0±0,1
Глутаминовая кислота 36,5±0,1
Пролин 20,0±0,06
Глицин 7,5±0,05
Аланин 16,5±0,05
Лизин 25,0±0,15
Гистидин 11,0±0,12
Аргинин 29,0±0,05
Пример 2.

Ферментативный гидролиз мышечной ткани ластоногих проводят аналогично примеру 1 с тем отличием, что процесс ведут при температуре 42^oC в щелочной зоне 7,8 в течение 4 суток. Гидролиз прекращают прогреванием биомассы при температуре 90^oC в течение 5 минут. Для осаждения высокомолекулярных соединений используют 22%-ный раствор хлористого кальция.

Физико-химические характеристики высушенного ферментативного гидролизата ластоногих находятся в пределах, указанных для продукта, полученного в примере 1.

Строгое соблюдение условий гидролиза и регулярный контроль физико-химических параметров гидролизата в процессе гидролиза позволяет получать в достаточной степени стандартный продукт, имеющий разбросколичетвенных показателей аминокислот не более 5 6%
Пример 3.

Подобрана концентрация ферментативного гидролизата мышечной ткани ластоногих, обеспечивающая оптимальные условия жизнедеятельности перевиваемой линии клеток почки человека RH-PA. Результаты представлены в табл. 1.

Из приведенных в табл. 1 данных следует, что оптимальные условия для роста и развития клеток обеспечивает ПС, содержащая 0,15 0,20 об. ферментативного гидролизата мышечной ткани ластоногих (что соответствует содержанию аминного азота 14 15 мг соответственно содержанию аминного азота в ПС 199).

Пример 4.

Биологические ростовые свойства предлагаемой ПС испытывали при культивировании гетероплоидных перевиваемых линий клеток: почки человека RH-PA и СПЭВ в сравнении с ПС 199 производства ИПМ и ВЭ АМН РФ и дополненной 5% сыворотки КРС (табл. 2). Из представленных в табл. 2 данных следует, что ПС "Целат" (0,2 об. ферментативного гидролизаата мышечной ткани ластоногих на растворе Хенкса) с 5% сыворотки КРС обладает ростстимулирующими свойствами, идентичными ростстимулирующим свойствам ПС 199 производства ИПМ и ВЭ АМН РФ.

Пример 5.

Проведена оценка ростстимулирующих свойств ПС "Целат" в процессе длительного пассирования на ней перевиваемой линии клеток почки человека RH-PA в сравнении с синтетической ПС 199. Концентрация клеток при засеве 1,0 - 1,5•10⁵ кл/мл, концентрация сыворотки КРС 5% коэффициент пересева 1:3. Сроки формирования монослоя 3 4 сутки. Данные представлены в табл. 3.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при длительном пассировании перевиваемой культуры клеток почки человека RH-PA ростстимулирующая активность ПС "Целат" аналогична ростстимулирующей активности ПС 199.

Пример 6.

Определена способность ПС "Целат" обеспечивать восстановление жизнеспособности перевиваемой линии клеток почки человека RH-PA, замороженных на 30-ом пассаже после криоконсервации. Полученные данные представлены в табл. 4.

Данные, представленные в табл. 4, свидетельствуют о том, что клетки, выращенные в ПС "Целат", сохраняют хорошую жизнеспособность и к 5-му пассажу после размораживания полностью восстанавливают свои свойства.

Таким образом, описываемый способ получения ферментативного гидролиза позволяет упростить технологию процесса и снизить себестоимость конечного продукта за счет использования отходов зверобойного промысла мышечной ткани ластоногих, а в качестве фермента неутилизируемых отходов того же промысла - ферментсодержащих органов ластоногих.

Питательная среда "Целат" на основе полученного ферментативного гидролизата мышечной ткани ластоногих обладает высокими ростстимулирующими свойствами для некоторых первичных, а также перевиваемых гетероплоидных линий клеток животных и человека, что позволяет применять ее для получения больших количеств клеточной биомассы в биотехнологических производствах вместо многокомпонентной синтетической питательной среды 199, аминокислоты для получения которой закупаются за рубежом.

Область использования: медицинская биотехнология, биологическая промышленность и ветеринария. Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения ферментативного гидролизата измельченную мышечную ткань ластоногих, смешанную с дистиллированной водой в массовом соотношении 1:2, подвергают гидролизу в присутствии ферментсодержащих органов ластоногих при температуре 40 - 42^oC, при рН 7,6 - 7,8 в течение 4 - 5 суток в присутствии хлороформа с последующим прогреванием биомассы при температуре 80 - 90^oC в течение 5 - 10 минут, осаждением высокомолекулярных соединений сначала в присутствии 20 - 22%-го раствора хлористого кальция, затем - в изоэлектрической точке белка, фильтрованием препарата и высушиванием. Сущность изобретения заключается также в том, что питательная среда "Целат" для культивирования клеток эукариотов содержит ферментативный гидролизат мышечной ткани ластоногих, сыворотку крови крупного рогатого скота и раствор Хэнкса при следующем соотношении компонентов в об.%: ферментативный гидролизата мышечной ткани ластоногих - 0,15 - 0,20, сыворотка крови крупного рогатого скота - 5,0 - 10,0, раствор Хэнкса - остальное. 2 с.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ получения ферментативного гидролизата из мышечной ткани ластоногих, включающий измельчение мышечной ткани, разведение ее водой, гидролиз ферментсодержащими органами, осаждение биомассы, высушивание, отличающийся тем, что разведение мышечной ткани осуществляют дистиллированной водой, гидролиз проводят при 40 42^oС, рН 7,6 7,8 в течение 4 5 суток в присутствии хлороформа, а осаждение биомассы проводят сначала в присутствии раствора хлористого кальция, а затем в изоэлектрической точке белка. 2. Питательная среда для культивирования клеток эукариотов, содержащая источник питательных веществ и ростстимулирующих факторов, отличающаяся тем, что в качестве источника питательных веществ и ростстимулирующих факторов она содержит ферментативный гидролизат мышечной ткани ластоногих, сыворотку крови крупного рогатого скота и дополнительно раствор Хэнкса при следующем соотношении компонентов, об.

Ферментативный гидролизат мышечной ткани ластоногих 0,15 0,20
Сыворотка крови крупного рогатого скота 5 10
Раствор Хэнкса Остальноер