ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЭУКАРИОТОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСНОВЫ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ - ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ГИДРОЛИЗАТА Российский патент 1998 года по МПК C12N5/00 A23J3/04 A23J3/30 

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной биотехнологии и касается усовершенствованного способа получения протеолитического гидролизата отходов переработки рыбы, а также питательной среды на его основе, предназначенной для выращивания клеток эукариотов - продуцентов биологически активных веществ, используемых для производства диагностических и профилактических биологических и медицинских препаратов.

Известен способ получения основы питательных сред включающий измельчение белоксодержащего сырья (внутренние органы рыб) его гидролиз в присутствии хлороформа в щелочной среде при температуре 40-42^oС в течение 2-2,5 сут с последующим прогреванием биомассы при температуре 90^oС в течение 5-10 мин и осаждением высокомолекулярных соединений в изоэлектрической точку белка [1].

Известен способ получения основы питательных сред путем гидролиза кильки в присутствии поджелудочной железы крупного рогатого скота при температуре 37-40^oС в течение суток с последующим прогреванием биомассы при 80^oС в течение 5-10 мин с последующим фильтрованием и высушиванием. Протеолитический гидролизат содержит не менее 18 аминокислот [2]. Однако, указанный процесс получения основы питательных сред включает использование дорогостоящего продукта - фермента поджелудочной железы.

Известна питательная среда (ПС), полученная из продуктов ферментативного гидролиза белка молока (ГЛА) [3] производства фирмы "Дифко" (США), которая используется, главным образом, для первично-трипсинизированных культур клеток.

Известна также ПС 199 для культивирования различных гетероплоидных перевиваемых клеток человека и животных [4]. ПС 199 содержит более 60 компонентов, в том числе 20 аминокислот, 17 витаминов, коэнзимы, глюкозу, минеральные соли и некоторые другие вещества; Среда полностью синтетическая. ПС 199 используется для длительного культивирования перевиваемых клеточных культур и обеспечивает высокую степень стандартности исследования. Недостатком является сложная технология ее изготовления из дорогостоящих реагентов. В условиях биотехнологического производства, где требуется большое количество питательной среды для получения клеточной биомассы ПС 199 не рентабельна.

Задачей изобретения является упрощение технологии получения протеолитического гидролизата и снижение себестоимости конечного продукта - основы питательной Среды, а также создание новой питательной Среды Автофизат-1 для культивирования клеток эукариотов.

Сущность изобретения заключается в том, что измельченную белоксодержащую массу-гомогенат, состоящую из отходов промысловых рыб на стадии разделки (неполноценные тушки и кишечник, содержащий протеолитические ферменты), смешивают с водой в весовом соотношении 1:1, выдерживают при температуре 40-42^oС при рН 7,6-8,0 в присутствии хлороформа при перемешивании в течение 18 ч с последующим прогреванием биомассы при температуре 90^oС в течение 5-10 мин, осаждением высокомолекулярных соединений в изоэлектрической точке белка, фильтрованием и высушиванием конечного продукта.

Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда Автофизат-1 для культивирования клеток эукариотов содержит протеолитический гидролизат (ПГ) гомогената отходов промысловых рыб и внутренних органов при следующем соотношении компонентов, об.%:
ПГ гомогената отходов промысловых рыб и внутренних органов - 0,15-0,20
Сыворотка крови КРС - 5-10
Раствор Хенкса - Остальное
Полученный описываемым способом протеолитический гидролизат отходов промысловых рыб и внутренних органов - полноценный продукт, содержащий в своем составе 18 свободных аминокислот, в том числе все незаменимые для культивирования изолированных клеток человека и животных, а также набор витаминов, включая группу В и витамин Е (табл.1).

Для изготовления ферментативного гидролизата не требуется экзогенных протеолитических ферментов, а ПС на его основе обеспечивает стандартные условия культивирования клеток эукариотов. Среда полноценна в отношении всех жизненно необходимых изолированной клетке компонентов, обеспечивает стандартные условия культивирования изолированных клеток с типичной морфологией без признаков цитопатологии в течение длительного срока.

Пример 1. Получение протеолитического гидролизата.

Отходы промысловых рыб (тушки и кишечник лососевых и тресковых) промывают проточной водой и измельчают. Гомогенат разводят дистиллированной водой в весовом соотношении 1:1 и проводят гидролиз при температуре 42^oС при рН 7,8 в присутствии хлороформа (1,0 об.%) при перемешивании в течение 18 ч.

Гидролиз прекращают прогреванием при температуре 90^oС в течение 10 мин. При этом коагулируют и выпадают в осадок неразгидролизованные белки.

Оставшиеся в надосадочной жидкости высокомолекулярные соединения осаждают в изоэлектрической точке белка, надосадочную жидкость фильтруют, затем подвергают высушиванию в потоке горячего воздуха, методом распыления. Режим высушивания (на входе 130^oС на выходе 70^oС) обеспечивает получение сухого препарата с остаточной влажностью не более 3,0%. Полученный продукт имеет следующие физико-химические характеристики:
Тонкодисперсный порошок, гигроскопичный, от белого до светло-кремового цвета с характерным запахом без гнилостного;
рН 1%-ного раствора - 5,5-6,5;
Растворимость, % - не менее 10;
Массовая доля общего азота, % - 11-12;
Массовая доля аминного азота, % - 5,5-6,5;
Массовая доля свободных аминокислот, % - 50-60.

Аминокислотный состав сухого конечного продукта (%) приведен в табл.2.

Строгое соблюдение условий процесса и регулярный контроль физико-химических параметров продукта в процессе гидролиза позволяет получать в достаточной степени стандартный результат, имеющий разброс количественных показателей аминокислот не более 5-6%.

Пример 2. Подобрана концентрация протеолитического гидролизата отходов промысловых рыб и внутренних органов рыб, обеспечивающая оптимальные условия жизнедеятельности перевиваемой линии клеток почки человека RH-PA.

Результаты представлены в табл.3.

Из приведенных в табл.3 данных следует, что оптимальные условия для роста и развития клеток обеспечивает ПС, содержащая 0,15-0,2 об.% ферментативного гидролизата отходов промысловых рыб и внутренних органов рыб (что соответствует содержанию аминного азота 14-15 мг% соответственно содержанию аминного азота в ПС 199).

Пример 3. Биологические ростовые свойства предлагаемой ПС испытывали при культивировании гетероплоидных перевиваемых линий клеток: почки человека RН-РА и СПЭВ в сравнении с ПС 199 производства ИПМ и ВЭ АМН РФ (все Среды дополнены 5% сыворотки КРС) (табл.4). Из представленных в табл.4 данных следует, что ПС Автофизат-1 (0,2 об.% протеолитического гидролизата отходов рыб на растворе Хенкса) обладает ростстимулирующими свойствами, идентичными ростстимулирующим свойствам ПС 199 производства ИПМ и ВЭ АМН РФ.

Видовая специфичность разных пород рыб, использованных для получения гидролизата, не оказывает влияния на ростстимулирующие свойства конечного продукта.

Пример 4. Проведена оценка ростстимулирующих свойств ПС Автофизат-1 в процессе длительного пассирования (табл.5) на ней перевиваемой линии клеток почки человека RH-РА в сравнении с синтетической питательной средой 199. Концентрация клеток при засеве 1,0-1,5 х 10 кл/мл, концентрация сыворотки КРС 5%, коэффициент пересева 1:3. Сроки формирования монослоя 3-4 сут.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при длительном пассировании перевиваемой культуры клеток почки человека RH-РА ростстимулирующая активность ПС Автофизат-1 аналогична ростстимулирующей активности ПС 199.

Пример 5. Определена способность ПС Автофизат-1 обеспечивать восстановление жизнеспособности перевиваемой линии клеток почки человека RH-РА, замороженных на 30-ом пассаже после криоконсервации.

Полученные данные представлены в табл.6.

Данные, представленные в табл. 6, свидетельствуют о том, что клетки, выращенные в ПС Автофизат-1, сохраняют хорошую жизнеспособность и к пятому пассажу после размораживания полностью восстанавливают свои свойства.

Таким образом описываемый способ получения ферментативного гидролизата позволяет сохранить технологию процесса и снизить себестоимость конечного продукта за счет использования белоксодержащих отходов рыболовных промыслов и ферментсодержащих внутренних органов рыб.

Питательная среда "Автофизат-1" на основе полученного ферментативного гидролизата отходов рыболовных промыслов и ферментсодержащих внутренних органов рыб обладает хорошими ростстимулирующими свойствами как для первичных, так и для перевиваемых гетероплоидных линий клеток животных и человека, что позволяет применять ее для получения больших количеств клеточной биомассы в биотехнологических производствах наряду и вместо многокомпонентной синтетической питательной средой ПС 199.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Патент РФ N 2001101, кл. Е 12 N 1/20, 15.10.93.

2. Справочник по микробиологическим питательным средам. Под редакцией Меджидова М.М., Махачкала, 1989, с.104.

3. Melnick f., Riordan f., "Polyomyelitis viruses in tissue culture IV. Protein free nutrient media in stationary and roller tube culture. Proc.Soc. Exp.Biol.Med., 1452, 81, p.208-213.

4. Morgan f.F. et al.Nutrition of animal cells in tissue culture I.Ynitial studies on a synthatic medium. Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 1950, 78,1, p. 1-8.

Использование: в биотехнологии, ветеринарии и медицине. Сущность изобретения: питательная среда для культивирования клеток эукариотов включает сыворотку крови крупного рогатого скота, раствор Хенкса и протеолитический гидролизат отходов рыболовных промыслов, который получают путем протеолитического гидролиза отходов тушек промысловых рыб, измельченных с кишечником в щелочной среде. Смесь перемешивают с дистиллированной водой в соотношении 1: 1. Гидролиз ведут до массовой доли аминного азота 5,5-5,6% и свободных аминокислот 50-60%, 2 с.п.ф-лы, 6 табл.

1. Питательная среда для культивирования клеток эукариотов, включающая сыворотку крови крупного рогатого скота и раствора Хенкса, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит протеолитический гидролизат отходов рыболовных промыслов, полученный путем протеолитического гидролиза отходов тушек промысловых рыб, измельченных совместно с кишечником в щелочной среде, при следующем соотношении компонентов, об.

Протеолитический гидролизат отходов рыбных промыслов 0,15 0,20
Сыворотка крови крупного рогатого скота 5 10
Раствор Хенкса Остальное
2. Способ получения основы питательной среды протеолитического гидролизата для культивирования клеток эукариотов, предусматривающий протеолитический гидролиз отходов рыболовных промыслов в щелочной среде, температурную инактивацию, фильтрование и высушивание, отличающийся тем, что в качестве отходов рыболовных промыслов используют отходы тушек промысловых рыб, которые измельчают совместно с кишечником, затем смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1 1, гидролиз ведут при температуре 40 42^oС до массовой доли аминного азота 5,5 6,5% и массовой доли свободных аминокислот 50 60% температурную инактивацию проводят в изоэлектрической точке.