СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА И ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА "ЭПИДЕРМАТ-2" ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЭУКАРИОТОВ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/00 C12N1/20 C12N5/00 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и биологической промышленности, ветеринарии и касается усовершенствованного способа получения ферментативного гидролизата, а также питательной среды на его основе, предназначенной для культивирования клеток эукариотов продуцентов биологически активных веществ, диагностических и профилактических биологических и медицинских препаратов.

Известен способ получения ферментативного гидролизата белков мышц (ФГМ-С) путем тщательного измельчения мышечной ткани и поджелудочной железы крупного рогатого скота на коллоидной мельнице с последующим глубоким ферментативным гидролизом, осаждением высокомолекулярных соединений в изоэлектрической точке белка, фильтрованием препарата и его высушиванием (1). ФГМ-С содержит не менее 18 аминокислот, суммарное количество которых составляет 63-69% Ферментативный гидролизат мышечных белков используют в качестве основы культуральной питательной среды, на которой выращивают первичные и перевиваемые культуры клеток животных. Однако известный способ предусматривает использование в качестве белоксодержащего сырья для гидролизата мышечной ткани крупного рогатого скота, являющейся пищевым белком.

Известна питательная среда (ПС), полученная из продуктов ферментативного гидролиза полноценного белка молока (ГЛА), которая используется главным образом для первично-трипсинизированных культур клеток. Однако в связи с тем, что ГЛА изготавливается фирмой ДИФКО (США) и импортируется в Российскую Федерацию, резко возрастает стоимость вирусных вакцин и других препаратов, сырьем для которых является ГЛА.

Известна также питательная среда 199 для культивирования различных гетероплоидных перевиваемых клеток человека и животных (2). Питательная среда 199 содержит более 60 компонентов, в том числе 20 аминокислот, 17 витаминов, коэнзимы, глюкозу, минеральные соли и некоторые другие вещества; среда полностью синтетическая. ПС 199 используется для длительного культивирования перевиваемых клеточных культур и обеспечивает высокую степень стандартности исследования. Недостатком ее является сложная технология изготовления из дорогостоящих, главным образом импортных реагентов. В условиях биотехнологического производства, где требуется большое количество питательной среды для получения клеточной биомассы, ПС 199 нерентабельна.

Задачей изобретения является упрощение технологии получения ферментативного гидролизата и снижение себестоимости конечного продукта, а также создание новой питательной среды "Эпидермат-2" для культивирования клеток эукариотов.

Сущность изобретения заключается в том, что предварительно отмытую от солевого консерванта, проавтоклавированную и измельченную массу спилка шкур ластоногих и/или спилка шкур крупного рогатого скота, смешанную с дистиллированной водой в массовом соотношении 1:1,5, подвергают гидролизу в присутствии протеолитического фермента, взятого в количестве 12-15 об. и процесс ведут при температуре 37-38^oC в течение 4-5 суток в щелочной зоне рН 7,6-7,8 в присутствии хлороформа с последующим прогреванием полученной биомассы при температуре 90-95^oC в течение 3-5 мин, осаждением высокомолекулярных соединений 20-22% -ным раствором хлористого кальция, затем - в изоэлектрической точке белка, фильтрованием полученного препарата и его высушиванием.

В качестве сырья для получения ферментативного гидролизата (ФГ) используют непищевой белоксодержащий отход мехового производства спилок шкур ластоногих и/или спилок крупного рогатого скота.

Сущность изобретения заключается также в том, что питательная среда "Эпидермат-2" для культивирования клеток эукариотов содержит ферментативный гидролизат спилка шкур ластоногих и/или спилка шкур крупного рогатого скота, сыворотку крови крупного рогатого скота и раствор Хэнкса при следующем соотношении компонентов, об.

ферментативный гидролизат спилка шкур ластоногих и/или шкур крупного рогатого скота 0,15-0,20
сыворотка крови крупного рогатого скота 5-10
раствор Хэнкса остальное
Полученный описываемым способом ферментативный гидролизат спилка шкур ластоногих и/или шкур крупного рогатого скота дешевый полноценный продукт, не требующий для своего изготовления дорогостоящего оборудования, а ПС на его основе обеспечивает в достаточной степени стандартные условия культивирования клеток эукариотов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получения ферментативного гидролизата.

Спилок шкур нерпы отмывают от солевого консерванта проточной водой, автоклавируют при 1,5 атм в течение 30-40 мин, измельчают, разводят дистиллированной водой в массовом соотношении 1:1,5 и подвергают гидролизу протеолитическим ферментом поджелудочной железой свиньи, взятой в количестве 12-15 об. Процесс ведут в щелочной зоне рН 7,6-7,8 при температуре 37-38^oC в течение 4-5 суток (период прекращения увеличения аминного азота) в присутствии хлороформа (1,0-1,5 об.) с последующим прогреванием полученной биомассы при температуре 90-95^oC в течение 3-5 мин. Осадок удаляют центрифугированием. Оставшиеся в надосадочной жидкости высокомолекулярные соединения осаждают сначала в присутствии 20-22%-ного раствора хлористого кальция, а затем в изоэлектрической точке белка. Надосадочную жидкость фильтруют и подвергают высушиванию в потоке горячего воздуха методом распыления.

Полученный ферментативный гидролизат спилка шкур нерпы имеет следующие физико-химические характеристики:
концентрация водородных ионов 1%-ного раствора 6,5-6,8
растворимость, не менее 5,0
массовая доля влаги, не более 5,0
массовая доля общего азота, 10,0-11,0
массовая доля аминного азота, 5,5-6,0
Аминокислотный состав 1%-ного раствора полученного ферментативного гидролизата представлен в табл.1.

Строгое соблюдение условий гидролиза и регулярный контроль физико-химических параметров гидролизата в процессе гидролиза позволяет получать в достаточной степени стандартный продукт, имеющий разброс количественных показателей аминокислот не более 5-6%
Пример 2. Получение ферментативного гидролизата.

В качестве сырья используют спилок шкур крупного рогатого скота и процесс гидролиза ведут аналогично примеру 1. Физико-химические показатели полученного продукта находятся в пределах величин, указанных для ферментативного гидролизата, полученного в примере 1. Аминокислотный состав 1%-ного раствора полученного гидролизата представлен в табл.1.

Пример 3. Подобрана концентрация ферментативного гидролизата спилка шкур ластоногих, обеспечивающая оптимальные условия жизнедеятельности перевиваемой линии клеток почки человека RH-PA. Результаты представлены в табл.2, где показано влияние концентрации ФГ спилка шкур ластоногих в составе питательной среды "Эпидермат-2" на жизнедеятельность перевиваемой линии клеток почки человека RH-PA в течение четырех суток роста (концентрация клеток при засеве 1,0-1,5•10⁵ кл/мл, концентрация сыворотки КРС 5 об.).

Из приведенных в табл.2 данных следует, что оптимальные условия для роста и развития клеток обеспечивает ПС, содержащая 0,15-0,20 об. ФГ спилка шкур ластоногих (что соответствует содержанию аминного азота 14-15 мг. соответственно содержанию аминного азота в ПС 199).

Аналогичные результаты получены при использовании в качестве питательной основы ферментативного гидролизата спилка шкур крупного рогатого скота.

Пример 4. Биологические ростовые свойства предлагаемой ПС испытывали при культивировании гетероплоидных перевиваемых линий клеток: почки человека RH-PA и СПЭВ в сравнении с ПС 119 производства ИПМ и ВЭ АМН РФ, дополненной 5 об. сыворотки крови КРС (табл.3). Из представленных в табл.3 данных следует, что ПС "Эпидермат-2" (0,2 об. ферментативного гидролизата спилка шкур ластоногих и/или спилка шкур крупного рогатого скота на растворе Хэнкса) с 5 об. сыворотки крови КРС обладает ростстимулирующими свойствами, идентичными ростстимулирующим свойствам ПС 199 производства ИПМ и ВЭ АМН РФ.

При добавлении в питательную среду "Эпидермат-2" полученного ферментативного гидролизата спилка шкур ластоногих и/или шкур крупного рогатого скота в количестве 0,15 об. и сыворотки крови КРС в количестве 10 об. получены аналогичные результаты.

Пример 5. Проведена оценка ростстимулирующих свойств ПС "Эпидермат-2" в процессе длительного пассирования на ней перевиваемой линии клеток почки человека RH-РА в сравнении с синтетической ПС 199. Концентрация клеток при засеве 1,0-1,5•10⁵ кл/мл, концентрация сыворотки крови РКС 5 об. коэффициент пересева 1:3. Сроки формирования монослоя 3-4 суток. Результаты представлены в табл.4.

Данные, представленные в табл. 4, свидетельствуют о том, что при длительном пассировании перевиваемой культуры клеток почки человека RH-PA ростстимулирующая активность ПС "Эпидермат-2" аналогична ростстимулирующей активности ПС 199.

Пример 6. Определена способность ПС "Эпидермат-2" обеспечивать восстановление жизнеспособности перевиваемой линии клеток почки человека RH-PA, замороженных на 15-м пассаже после криоконсервации. Полученные данные представлены в табл.5.

Данные, представленные в табл. 5, свидетельствуют о том, что клетки, выращенные в ПМ "Эпидермат-2", сохраняют хорошую жизнеспособность и к 4-5-му пассажу после размораживания полностью восстанавливают свои свойства.

Таким образом, описываемый способ получения ферментативного гидролизата позволяет упростить технологию получения и снизить себестоимость конечного продукта за счет использования в качестве белоксодержащего сырья неутилизируемых непищевых отходов мехового промысла спилка шкур ластоногих или шкур крупного рогатого скота.

Новая питательная среда "Эпидермат-2" на основе полученного ферментативного гидролизата спилка шкур ластоногих и/или шкур КРС обладает высокой ростстимулирующей активностью для некоторых первичных, а также перевиваемых гетероплоидных линий клеток животных и человека, что позволяет применять ее для получения больших количеств клеточной биомассы вместо многокомпонентной синтетической питательной среды 199. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3

Область использования: медицинская биотехнология, биологическая промышленность и ветеринария. Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения ферментативного гидролизата предварительно отмытую от солевого консерванта, проавтоклавированную и измельченную массу спилка шкур ластоногих или спилка шкур крупного рогатого скота, смешанную с дистиллированной водой в массовом соотношении 1:1,5, подвергают гидролизу в присутствии протеолитического фермента, взятого в количестве 12-15 об.%, и процесс ведут при температуре 37-38^oC в течение 4-5 суток при рН 7,6-7,8 в присутствии хлороформа с последующим прогреванием полученной биомассы при температуре 90-95^oC в течение 3-5 мин, осаждением высокомолекулярных соединений сначала 20-22%-ным раствором хлористого кальция, затем - в изоэлектрической точке белка, фильтрованием и высушиванием полученного продукта. Сущность изобретения заключается также в том, что питательная среда "Эпидермат-2" для культивирования клеток эукариотов содержит ферментативный гидролизат спилка шкур ластоногих или спилка шкур крупного рогатого скота, сыворотку крови крупного рогатого скота и раствор Хэнкса при следующем соотношении компонентов, об. %: ферментативный гидролизат спилка шкур ластоногих или крупного рогатого скота - 0,15-0,20, сыворотка крови крупного рогатого скота - 5-10, раствор Хэнкса - остальное. 2 с.п.ф-лы, 5 табл.

1. Способ получения ферментативного гидролизата, включающий ферментативный гидролиз измельченного белоксодержащего сырья, осаждение полученной биомассы, фильтрование продукта и его высушивание, отличающийся тем, что в качестве белоксодержащего сырья используют предварительно отмытую от солевого консерванта проавтоклавированную массу спилка шкур ластоногих или шкур крупного рогатого скота, смешанную с дистиллированной водой в отношении 1 1,5, гидролиз проводят при 37-38^oС с pH 7,6 7,8 в течение 4 5 суток в присутствии хлороформа, а осаждение биомассы проводят сначала в присутствии раствора хлористого кальция,а затем в изоэлектрической точке белка. 2. Питательная среда для культивирования клеток эукариотов, содержащая источник питательных веществ и ростстимулирующих факторов, отличающаяся тем, что в качестве источника питательных веществ и ростстимулирующих факторов она содержит ферментативный гидролизат спилка шкур ластоногих или шкур крупного рогатого скота, сыворотку крови крупного рогатого скота и дополнительно раствор Хэнкса при следующем соотношении компонентов, об.

Ферментативный гидролизат спилка шкур ластоногих или шкур крупного рогатого скота 0,15 0,20
Сыворотка крови крупного рогатого скота 5 10
Раствор Хэнкса Остальное