Изобретение относится к способу получения производных S-аденозилметилонина (САМ) общей формулы
где R-бензол, п-толуолсульфонил или линейный алифатический ацильный радикал, содержащий 2-6 атомов углерода; R1 Н или бензоил или линейный алифатический ацил, содержащий 2-6 атомов углерода; R и R1 одинаковые или различные, когда R1 имеет значение, отличное от водорода; n 1-5; А является эквивалентом кислоты с рКа менее 2,5.
Известно, что САМ является веществом, которое присутствует во всех живых организмах, и принимает участие в значительном числе биологических процессов основополагающего значения в том смысле, что представляет основной донор метильных групп в организме.
Известно также, что вплоть до 1975 г какое-либо практическое применение САМ было невозможно из-за его чрезвычайно высокой нестабильности.
С 1975 г по настоящее время заявитель подал ряд патентов (патенты США 3 893 999, 3 954 726, 4 057 686), касающихся определенных солей САМ, которые, совершенно неожиданно, демонстрировали такую стабильность, которая позволила получать фармацевтические композиции, применимые в ряде областей лечения людей.
Хотя при этом и был ликвидирован один из отрицательных аспектов САМ, эти соли все еще не решали остальных проблем, связанных с этими продуктами, а именно, их низкую проницаемость сквозь клеточные барьеры и соответственно затрудненную абсорбцию организмом, особенно при оральном введении.
Новый класс продуктов, а именно продукты формулы 1 были открыты к настоящему моменту, и они и составляют предмет настоящего изобретения, этот класс продуктов, что было совершенно неожиданно доказано, обладает полной фармакологической активностью уже найденной для солей САМ, и обладает также аналогичной или даже более высокой стабильностью, даже при повышенной температуре, и большей биологической доступностью.
В частности, эта последняя характеристика дает возможность получать фармацевтические композиции для орального введения, что чрезвычайно удобно при лечении людей.
Новые продукты формулы 1 получают следующим образом.
В качестве исходного материала используют сульфат САМ.
Приготавливают раствор соли САМ в Н2О таким образом, чтобы концентрация САМ составляла 100 г/л.
Полученный раствор охлаждают до 1оС, а затем, постоянно поддерживая эту температуру за счет охлаждения, устанавливают рН 7 используя 2н. NaOH.
Эта процедура выглядит следующим образом в зависимости от того производного которое необходимо получить.
Моноацильные производные С2-С6 алифатических, бензольных или п-толуолсульфоновых кислот (R1-Н).
Ацилирующий агент (ангидрид или хлорид нужной кислоты по выбору) добавляют небольшими порциями в молярном соотношении в пределах 1:1,15-1:1,3 относительно САМ, поддерживая температуру 1оС и рН 7, добавляя NаОН.
В конце реакции (то есть, когда рН остается стабильным) температуре дают возможность повыситься до 20оС.
Полученный раствор разбавляют до концентрации 20 г/л и если образуется осадок, его отфильтровывают полностью.
Конверсия САМ в моноацильное производное превышает 90%
Полученный таким образом раствор хроматографируют на ионообменной смоле.
Триацильные производные С2-С6 алифатических бензольных и п-толуолсульфоновых кислот.
Ацилирующий агент добавляют в молярном количестве между (R1≠Н R1 и R одинаковые или отличаются один от другого) 1:4,8 и 1:7,8 по отношению к САМ, всегда поддерживая при этом температуру при 1оС а рН 7 за счет добавления 2н. NaOH.
В конце реакции температуре дают возможность повыситься до 20оС.
Конверсия САМ в триацильное производное составляет около 80%
Раствор разбавляют до концентрации 20 г/л и отфильтровывают любое выпавший осадок.
Полученный при этом раствор хроматографируют на ионообменной смоле.
Во всех описанных случаях используют колонку со слабой кислотой смолой (АМБЕRLITE IRC 50 или CG 50 в форме Н+) предварительно промытую водой, а рабочие пара- метры колонки поддерживают следующими:
отношение диаметра к высоте слоя смолы 1:10,
загрузка 20 г производного САМ/л смолы,
скорость потока 1 об. колонка/ч. Затем колонку промывают 1 об. Н2О и 0,1 н. уксусной кислоты до тех пор, пока рН элюата не установится 3. Ее промывают 20 мн Н2SO4 до завершения элюирования оставшегося САМ и остальных побочных продуктов, а целевой продукт элюируют 0,1 н. Н2SO4 (или другой сильной кислотой, если нужна другая соль).
Полученный таким образом раствор концентрируют в вакууме до 50 г/л.
Его фильтруют на активированном древесном угле (1/10 САМ производного), кислотную композицию устанавливают до нужного стехиометрического значения, и раствор лиофилизируют.
Далее приводятся несколько неограничивающих примеров получения САМ производных в соответствии с описанным ранее в целях иллюстрации настоящего изобретения.
П р и м е р 1. В 10 л Н2О растворяют такое количество сульфата САМ, которое соответствует 1 кг ионов САМ, а затем охлаждают до 1оС.
рН устанавливают 7 с помощью 2 н. NaOH, причем температуру поддерживают постоянной за счет циркуляции охлаждающей жидкости.
По-прежнему поддерживая температуру 1оС, добавляют 285 мл уксусного ангидрида за промежуток времени 1 час, поддерживая в то же время рН 7 за счет добавления 2 н. NаОН.
После добавления уксусного ангидрида рН дают возможность стабилизироваться при той же самой температуре, после чего температуре дают возможность повыситься до 20оС. Выход конверсии в моноацетильное производное составляет 95% Реакционную смесь разбавляют 20 л дистиллированной воды.
Отдельно подготавливают колонку с 50 л АМВЕRLITE IRC 50 смолы в форме Н+, предварительно активированной 100 л 0,5 н. Н2SO4, и промытый до нейтральной реакции. Реакционную смесь пропускают через колонку со скоростью 50 л/ч.
Ее промывают 50 л дистиллированной воды. Через колонку пропускают 0,1 л раствор уксусной кислоты (около 400 л) до тех пор, пока рН элюата не становится 3. Колонку промывают 50 л 20 мн Н2SO4 для элюирования последних следов непрореа- гировавшего САМ. Ее элюируют 50 л 0,1 н Н2SO4. Раствор концентрируют в вакууме (30 мм рт.ст. 35оС) до около 1 л. Его обрабатывают 50 г активированного древесного угля и фильтруют.
Раствор титруют и добавляют достаточное количество серной кислоты для достижения молярного отношения моноацетил САМ/Н2SO 1:2, после чего его лиофилизируют. Получают 900 г соли моноацетила САМ˙2 Н2SO4 ˙0,5 Н2О, следующей композиции: Моноацетил САМ 68,3% Н2SO 30,3% Н2О 1,4%
что соответствует выходу 61,5% по отношению к САМ.
При анализе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (колонка РАRTISIL 10 SCX, элюент 0,1 М муравьинокислый аммоний, рН 4, 20% метанола, скорость потока 1 мл/мин, полученный продукт дает одиночный пик со временем удерживания 360 с.
Полученный продукт идентифицировали с помощью УФ и ЯМР.
Спектр У. Ф. при рН 4 максимум поглощения при 258 нм ε= 14040, при рН 1 максимум поглощения при 256 нм ε= 13500.
Спектр ЯМР: 2 млн. д. синглет ацетильной группы, 3 млн.д. синглет S-СН3 группы.
Продукт не дает положительной реакции на тест нингидрина, что указывает на модификацию аминокислотной группы.
Устанавливая молярное стехиометрическое соотношение 1,5 или 2,5 по отношению к серной кислоте перед лиофилизацией получают следующие соли:
моноацетил САМ˙1,5 Н2SO4 ˙0,5 Н2О
моноацетил САМ˙2,5 Н2SO4 ˙0,5 Н2О
Используя соляную кислоту или метансульфокислоту вместо серной кислоты для элюирования колонки, получают следующие соли:
Моноацетил САМ ˙3 НСl ˙0,5 Н2О
Моноацетил САМ ˙4НСl˙0,5 Н2О
Моноацетил САМ ˙5 НСl˙0,5 Н2О
Моноацетил САМ ˙3СН3SO3Н˙0,5 Н2О
Моноацетил САМ ˙4СН3SO3Н˙0,5 Н2О
Моноацетил САМ ˙5СН3SO3Н˙0,5 Н2О
Спектр УФ и ЯМР всех этих солей были идентичны характеристикам указанных ранее продуктов.
Аналитические данные, касающихся этих солей, приведены в табл.1.
П р и м е р 2. Повторяли процедуру примера 1, однако использовали пропионовый ангидрид, масляный ангидрид, гексаноилхлорид, бензоилхлорид, паратолуолсуль- фонилхлорид, янтарный ангидрид, и глутаровый ангидрид, вместо уксусного ангидрида. Получили соответствующие SАМ-производные, аналитические характеристики для которых приведены в табл.2.
П р и м е р 3. Повторили процедуру примера 1, используя 1540 мл деканоилхлорида в около 15 л ацетона вместо уксусного ангидрида.
После завершения реакции раствор разбавили 20 л Н2О, ацетон выпаривали в вакууме и осадок декановой кислоты отфильтровали. По способу примера 1 получили соль деканоил САМ ˙2Н2SO4 ˙0,5 Н2О.
При анализе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в условиях примера 1 получили одиночный пик со временем удерживания 340 с.
УФ спектральные характеристики:
при рН 4 максимум поглощения 258 нм: ε= 14040
при рН 1 максимум поглощения 256 нм: ε= 13500
Используя октилхлорид и додецилхлорид вместо деканоилхлорида получили следующие продукты:
-n-Октил САМ ˙2Н2SO4˙0,5 Н2О
-н-додецил САМ˙ 2Н2SO4 ˙0,5 Н2О
Аналитические данные для этих продуктов приведены в табл.3.
П р и м е р 4. В 10 л Н2О растворяют такое количество соли САМ, которое эквивалентно 1 кг ионов САМ и охлаждают до 1оС. рН устанавливают 7 с помощью 2н. NaOH, поддерживая температуру 1оС постоянной за счет циркуляции охлаждающей жидкости.
Поддерживая температуру 1оС медленно добавляют 1200 мл уксусного ангидрида за промежуток времени 2 ч, поддерживая при этом рН 7 за счет добавления 2н. NaOH.
Выход в триацетильное производное составляет 80%
С этого момента следуют процедуре примера 1.
Получают 720 г соли триацетил САМ ˙2Н2SO4 ˙0,5 Н2О
триацетил САМ 71,9% Н2SO4 26,8% Н2О 1,3% что соответствует выходу 51,8% по отношению к САМ.
При анализе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в условиях примера 1 продукт дает одиночный пик со временем удержания 820 с.
Продукт также отличается следующими характеристиками УФ- и ЯМР спектров.
У. Ф-спектр: при рН 4 максимум поглощения при 258 нм, ε= 14050 при рН 1 максимум поглощения при 256 нм, ε= 13500 спектр ЯМР:
2 млн. д. синглет ацетила у метионина
2,2 млн д. синглет соответствующий 2 ацетилам на рибозе
3 млн. д, синглет S СН3 группы
Если вместо уксусного ангидрида используют масляный ангидрид, пропионовый ангидрид или бензойный ангидрид получают следующие продукты:
трипропионил САМ ˙2Н2SO4 ˙0,5 Н2О
трибутирил САМ˙ 2Н2SО4 ˙0,5 Н2О
трибензоил САМ ˙2Н2SO4 ˙0,5 Н2О
Аналитические характеристики триацетильных производных САМ приведены в табл.4.
П р и м е р 5. Повторили процедуру примера 2 до получения реакционных смесей содержащих гексаноил САМ, бензоил САМ и сукцинил САМ, соответственно.
С этого момента, поддерживая температуру 1оС за промежуток времени 1 ч добавляют 1000 мл уксусного ангидрида поддерживая рН 7 за счет добавления 2н NaOH. Далее следуют процедуры примера 1.
Получают следующие триацетильные производные смешанного типа:
гексаноил-диацетил САМ˙2Н2SO4˙0,5 Н2О
бензоил-диацетил САМ ˙2Н2SO4 ˙0,5 Н2О
сукцинил-диацетил САМ˙2Н2SO4˙0,5 Н2О
аналитические характеристики которых приведены в нижеследующей табл.5.
Стабильность полученных САМ производных выше, чем САМ солей. Табл.6 показывает стабильность САМ-ацил производных в сухом состоянии при 45оС по сравнению с САМ.
Другое отличительное свойство производных формулы 1 заключается в их способности проникать через клеточные барьеры и демонстрируется результатами, приведенными ниже в табл.7.
В испытании, известном как "in situ" (кишечные мешочки) 2 мг каждого испытываемого продукта в 1 мл физиологического раствора помещали в кишечных мешочках крысам под эфирной анастезией. Крысы погибали через 2 ч и остаточное содержание мешочка (стенка + содержание) брали на анализ. Определенное таким образом количество мигрировавшего продукта приводится в табл.7 в от исходного количества в мешочке.
В другом опыте использовались кусочки вывернутой кишки, выдержанные при 37оС по методу Кребса Риндера против внешней концентрации продукта в 10-4 М.
Количество абсорбированного продукта, подтвержденное анализом, приводится в табл.7 в виде удельной величины, т.е. моль/час/мг ткани.
Соединения формулы I хорошо абсорбируются кишечником, более интенсивно, чем САМ-сульфат, что позволяет получать более высокие концентрации активного соединения в плазме при оральном назначении по сравнению с использованием САМ-сульфата.
Способность солей сложных эфиров САМ проникать через клеточные барьеры.
Соединения формулы 1 хорошо абсорбируются кишечником, более приемлемы и никакого тератогенического действия или злокачественных новообразований на зародышах или выросших плодах не проявляют.
При внутривенном введении доз вплоть до 200 мг/кг у кроликов не вызывалось пирогенных явлений.
При внутривенном введении кроликам и крысам 40 мг/кг не наблюдалось изменений к каротидном давлении, частоте сердечных и дыхательных сокращений или на электрокардиограмме.
Локальная переносимость внутримышечных инъекций даже после повторения введений в течение 30-60 дней и внутривенных инъекций в маpгинальную вену наружного уха кроликов была превосходной.
Фармакология.
Полная серия тестов, проведенных на крысах, продемонстрировала, что новые продукты обладают весьма заметными защитными и разрешающими действиями при гепатитных стеатозах, вызванных гиперлипид-гипербелковой диетой по способу Хандлера, и при стеатозах, вызванных острыми алкогольными отравлениями и вызванных другими токсическими агентами при приеме в дозах 10 мг/кг САМ+
При экспериментальной гиперлипемии у крыс, например вызванной Ttilon S новые продукты продемонстрировали чрезвычайно заметную гиполипемическую активность, которая по отношению к использованным дозам (то есть 10 мг/кг) снова выраженная в САМ+) значительно превосходила другие препараты с гиполипемической активностью.
У цыплят с атеросклерозом, вызванным с помощью диеты обогащенной холестерином и фруктозой, при парэнтеральном введении новых продуктов в дозах 10 мг/кг снижалась холестеролемия и благоприятно модифицировались повреждения по сравнению с контрольными экземплярами по отношению к торакальной и абдоминальной аорте и мелким сосудам энцефалической основы.
Что касается фосфолипидного метаболизма, экспериментально было обнаружено, что имеется увеличение фосфатидилхолина в гепатитной ткани крыс при некомпенсированных стеатозах. Четкое повышение фосфатидилхолина было также определено в опытах гематических α-липопротеинов в экспериментальных альтерациях вызванных β,α-липопротеиновыми отношениями.
Во всех эти тестах имеются четкие указания на лечебное действие новых производных при нарушениях липидного метаболизма.
Следующую серию тестов проводили на крысах, и она продемонстрировала, что введение доз 1 мг/кг вызывает аккумуляцию гликогенных резервов на гепатитном и мускульном уровнях, что демонстрируется как гистохимическими методами так и по количественным измерениям. В экспериментальных диабетах, вызванных аллоксаном, количества инсулина, необходимого для возвращения гликемических значений к нормальным, значительно снижалось при введении эквивалента 0,5 мг/кг/САМ+.
Эта серия экспериментов продемонстрировала отчетливое положительное действие новых соединений настоящего изобретения на глюцидный метаболизм.
И наконец, крыс с экспериментально вызванной гиподиспротеинемией обрабатывали количествами 10 мг/кг производных САМ. Было обнаружено, что указанные продукты возвращают полные протеинемичные значения к нормальным, при существенном повышении уровня альбумина и, тем самым демонстрируют заметную протеиновую анаболическую активность.
Эти и другие аналогичные тесты продемонстрировали лечебную способность новых продуктов при нарушениях протидного метаболизма.
Новые продукты обладают также совершенно неожиданно обнаруженной значительной противовоспалительной и анальгетической активностью, не известной для структурных аналогов.
Испытания противовоспалительной и болеутоляющей активности соединений формулы 1 проводили в соответствии с процедурой предложенной Winter и др. результаты действия на edema вызванной каррагенином у крыс и реакции в испытании на мышах на горячей пластинке (метод Янссена и Ягено) приведены в табл.8.
Сульфат SAM при стоматическом применении не обладает какой-либо противовоспалительной и болеутоляющей активностью. Кроме того, противовоспалительная и болеутоляющая активности соединений формулы I выше по сравнению с аналогичными показателями, которые были получены для сульфата SAM при внутримышечном применении.
Сущность изобретения: продукт ф-лы I, где R-бензоил, п-толуолсульфонил или линейный алифатический C2-C6 R1 -водород, бензоил или алифатический линейный C2-C6 ацил, причем R и R1 могут быть одинаковыми или различными. А-эквивалент кислоты pКа меньше 2,5; n 1-5. Реагент 1: водный раствор сульфата S-аденозилметионина, содержит 100 г/л S-аденозилметионина. Реагент 2: ангидрид или хлорангидрид соответствующей кислоты. Условия реакции: pH 7, температура 1°С. Соотношение ангидрид или хлорангидрид и соль S-аденозилметионина 1:(1,15-1,3), если R1 -H и 1:(4,8-7,8), если R1 не водород. Соединения обладают протеиновой анаболической, противовоспалительной и болеутоляющей активностью, оказывают положительное действие на глюцидный метаболизм. Структура соединения ф-лы I 
8 табл.
где R бензоил, n-толуолсульфонил или линейный алифатический C2 - C6-ацил;
R1 водород, бензоил или алифатический линейный C2 - C6-ацил; причем R и R1 могут быть одинаковыми или различными, когда R1 не водород;
A эквивалент кислоты pKа < 2,5;
n=1 5,
отличающийся тем, что водный раствор сульфата S-аденозилметионина, содержащий 100 г/л S-аденозилметионина, обрабатывают ангидридом или хлорангидридом соответствующей кислоты при pH 7, которое поддерживают добавлением 2н. раствора NaOH, и при 1oС, причем соотношение указанного ангидрида или хлорангидрида и соли S-аденозилметионина составляет 1 1,15 - 1,3, если R бензоил, п-толуолсульфонил или линейный алифатический C2 - C6-ацил, R1 водород, или соотношение указанных компонентов составляет соответственно 1 4,8 7,8, если R имеет указанные значения, а R1 бензоил или алифатический линейный C2 C6-ацил, полученный продукт очищают пропусканием отфильтрованной реакционной смеси через колонку с ионообменной смолой Н+-типа, элюированием 0,1н. водным раствором НА-кислоты и после концентрирования к элюату добавляют НА-кислоту в количестве, необходимом для получения требуемого значения n, и полученную соль производного S-аденозилметионина выделяют при помощи лиофильной сушки.
| Патент США N 4057686, кл | |||
| Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов | 1921 |
|
SU7A1 |
