Способ получения S-аденозилметиониновых (САМ) солей Советский патент 1988 года по МПК C07H19/16 A61K31/7076 A61P1/16 

Ы

Изобретение относится к способу получения S-аденозилметиониновых (САМ)

М)

1Д334162

солей общей формулы

Изобретение касается гетероциклических веществ, в частности получения S-аденозилметиониновых солей минеральных сильных кислот с (количество молей последних 4, или 5, или 6), обладающих защитным и рассасывающим действием при гепатическом стеатозе. Цель - создание нового способа синтеза новых солей указанного класса. Процесс ведут из концентрированного водного раствора технической S-аденозилметиониновой соли, рН которого доводят до 6-7, затем очищают пропусканием через слабокисдоткую ионообменную смолу, злюируют разбавленным раствором (0,1 Н.) сильной минеральной кислоты с последующим титрованием до строго стехиометри- ческого количества к присутствующей S-адекозилметиониновой соли концентрированной неорганической кислоты. В другом случае титрование ведут сильно основной ионообменной смолой в ОН-форме с последующими упариванием злюата до достижения концентрации целевой соли 50-100 г/л и лиофилмзи- рованием преимущественно в присутствии инертного вещества (лучше маннита или порошкообразной кремниевой кислоты) . Новые соли обладают лучшей активностью, чем соответствующий дисуль- фат ди-пара-толуолсульфонат S-адено- зилметионина, и наряду с гепатозащит- ным действием оказывает еще антидеп- рессантную и противоревматоидную ак- тивность. 1 з.п. ф-лы, 8 табл. i 1 &9 С«д

Ш12

кЛтгцГл

N

CH-CH-CH-CH-CH2-S-CH2- СН2-СН-СОО пНХ

1Н2

I

он он

Q

где X - кислотный эквивалент сильной минеральной кислоты с рН меньше 2,55. п равно 4, 5 или 6, обладающих защитным и рассасывающим действием при ге- патическом стеатозе.

Цель изобретения - разработка способа синтеза новых солей S-адено- зштметионина, обладающих большей стабильностью при 45°С по сравнению со структурными аналогами - известными солями САМ ПХ, где X - кислотный эквивалент сильной кислоты, а п 1, 2 и 3, а также большей активностью в отношении защиты печени по сравнению с ближайшим структурным аналогом ди- сульфатом-ди-п-толуолсульфонатом S-аденознлметионина.

Пример 1. 110л этилацетата и 110 л воды добавляют при температуре окружающей среды к 900 кг дрожжей, обогащенных САМ (6,88 г/кг) в соответствии с методом Шлейка.

После энергичного перемешивания в течение 0,5 ч добавляют 500 л ) 0,35 н, серной кислоты и продолжают перемешивание в течение 1,5 ч.

Смесь -фильтруют и остаток промывают водой, получая 14QO л раствора, содержащего 4,40 г/л САМ, что соответствует 99,5% от присутствующего в исходном материале.

При перемешивании добавляют 23 кг пикрслоновой кислоты. Реакционную массу оставляют на ночь и затем осадок отделяют центрифугированием и промы- вают .водой.

Осадок при перемешивании растворяют при окружающей температуре в 62 л 1 н. раствора серной кислоты в метаноле . Затем после отфильтровывания следов нерастворенного вещества к раствору добавляют 500 л ацетона, ,

После полной седиментации осадка декантируют всплывший раствор, и неснрастворимьй осадок промывают малым количеством ацетона. Осадок растворяю в 800 л дистил.пированной воды, добавляют 2 кг обесцвеченного древесного- угля и смесь фильтруют.

Готовят колонку с 200 л Амберлита IRC 50 в Н форме и тщательно промывают дистиллированной водой.

К ранее полученному водному раствору добавляют 4,8 кг ледяной уксусной кислоты при перемешивании и затем добавляют 2 н. едкий натр вплоть до получения рН 6,5.

Раствор пропускают через колонку со смолой со скоростью 400 л/ч, которую поддерживают постоянной в течение всего процесса. Затем через Колонку пропускают последовательно 200 л дистиллированной воды, 1600 л 0,1 М уксусной кислоты и затем 200 л дистиллированной воды.

САМ элюируют 400 л 0,1 н. серной кислоты. Таким образом полученный элю ат содержит примерно 4 кг САМ и его концентрируют в вакууме до 60 л.

Добавляют 0,5 кг древесного угля, и смесь фильтруют. Раствор титруют.

Добавляют концентрированной серной кислоты до получения молярного отношения серной кислоты к САМ, равного 2,5:1. Раствор затем лиофили- зируют.

Получают 6,5 кг продукта, имеющего следующий состав: САМ 61%; . 37,5%j H,j,0 1,5%.

Соль имеет кристаллический вид и растворима в воде в количестве, большем 20%, давая при этом бесцветный раствор. Однако соль нерастворима в обычных органических растворителях.

Методом тонкослойной хроматографии установлено, что продукт не содержит каких-либо примесей.

314

В табл. 1 приведены данные анали- за, которые согласуются с элементным составом для соединения формулы

C,,,.

Новое соединение также идентифицировано энзиматическим методом, основанным на энзиматическом метилирова- НИИ никотинамида и гуанидинуксусной кислоты с помощью САМ.

При повторении процесса аналогичным образом, но с добавлением перед лио илизацией такого количества сер- ной кислоты, чтобы поднять молярное . отношение к САН до 3:1, получают САМ-ЗН БО OjTH O. Данные элементног анализа приведены в табл. 1.

Понижая молярное отношение /САМ перед лиофилизацией до 2:1, получают соль CAH- ZHjSO 0,4H,jO. Данны элементного анализа приведены в табл. 1.

Пример 2. Т 1,5 кг пикроло- новой кислоты, растворенной в 100 л изобутанола, добавляют к 700 л раствора, полученного лизированием дрожжевых клеток, используя те же исходные материал и способ, что и в приме ре 1.

После выдержки в течение ночи образующийся осадок отделяют центрифугированием. Осадок растворяют при окружающей температуре при перемешивании в 31 л однонормального раствора серной кислоты в этаноле.

После отфильтровывания малых количеств нерастворенного вещества к расвору добавляют 250 л серного эфира. Смесь выдерживают, фильтруют, и твердый отфильтрованный остаток промывают малым количеством воды. Твердый остаток сушат в вакууме.

Твердое вещество растворяют в 400 л воды, добавляют 1 кг обесцвеченного древесного угля, и смесь фильтруют . Добавляют ледяную уксусную кислоту, доводя рН до 6,5, и затем раство р пропускают через колонку с Амберлитом IRC 50 аналогично тому, как это осуществляют в примере 1.

САМ элюируют из колонки 200 л 0,1 н. соляной кислоты.- Элюат концентрируют в вакууме до 30 л. Добав- ляют 0,25 кг активированного древесного угля и смесь фильтруют. Раствор титруют и добавляют концентрирован- ной соляной кислоты в количестве,

достаточном для получения молярного отношения НС1/САМ равным 5:1. Раствор лиофилизируют.

Получают 2,8 кг продукта, имеющего следующий состав: САМ 67,6%; НС1 30,9%; 1,5%.

Соль имеет кристаллический вид, и растворима в воде в количестве большем 20%, давая при этом бесцветный раствор. Соль слабо растворима в обыч- Hbjx органических растворителях.

Методом тонкослойной хроматографии показано, что соединение не содержит каких-либо примесей. Хроматографию проводят способом, аналогичньм примеру 1.

Данные элементного анализа приведены в табл. 1 и согласуются с продуктом формулы

С,у H Ng05S-5HCl.

Новое соединение также идентифи- фицировано энзиматическим методом, описанным в примере 1.

Осуществляя процесс как в примере 1, возможно получить продукт, имеющий различную величину солеобразова- ния, и в частности, следу)ощие соли: САМ 4НС1 0,4Н40; САМ-6НС1 0,.

Аналитические данные для солей приведены в табл. 1,

Пример 3, Повторен процесс, описанный в примере 1 с той разницей, что.перед лиофилизацией добавляют к раствору 4,75 кг апирогенного маннита. Затем, раствор лиофилизируют обычным способом.

Добавление маннита позволяет получить продукт с остаточным содержанием влаги 0,1%,

Полученный таким образом продукт пригоден для превращения в инъектиру- емую фармацевтическую форму.

Пример 4. Повторена процедура примера 1, Перед лиофилизацией добавляют 4 кг Аэросиля (пылевидной кремниевой кислоты) . Полученную коллоидальную суспензию лиофилизируют.

Добавление Аэросиля позволяет получить продукт с остаточным содержа-) нием влаги 0,2%. Этот продукт пригоден для превращения в таблетки для персрального применения ,

Пример 5. Повторена процедура примера 2 с той разницей, что , САМ элюируют 0,1 М раствором фосфор51

ной кислоты, а не о,1 н. раствором соляной кислоты, как в примере 2,

Лиофилиэации предшествовало добавление концентрированной фосфорной кислоты в количестве, достаточном для получения молярного отношения кислоты к САМ, равным 5:1.

Получено 4,26 кг продукта, имеющего следующий состав: САМ 44,4%; Н5Р04 54,6%; 1%.

Данные элементного анализа -приведены в табл. 1 и согласуются с соединением, имеющим формулу:

C yHj2NgOgS 5H,P04-0,5H20.

Методом тонкослойной хроматогра- фии, аналогичной описанной в примере 1 , показано, что продукт не содер- жит каких-либо примесей.

Новое соединение также идентифицировано описанным в примере 1 энзима- тическим методом.

Повторяя операции примера 1, мож- но получить соединения, имеющие различные степени солеобразования, и в частности соли САМ АН РО 0,, САМ 5Н Р04 0, данные элементного анализа для которых приведены в табл. 1.

Кислоты, которые используются для получения новых солей по предлагаемому изобретению, имеют следующие значения рН: НС1 - рК меньше 0,5; - рК меньше 0,5 (первая стадия), рК 1,92 (вторая стадия); Н,Р04 - рК 2,12 (1 стадия).

Испытания на стабильность проведены на солях, полученных предлага- емым способом, выдерживанием продукта в термостатируемой печи при 45 С и определением процента остаточной соли в фиксированные моменты временив Для сравнения эксперименты были повто рены с известными САМ-пНС1 солями, в которых п 1, 2иЗ, НС. CAM-nH SO, в которых п равно 0,5, 1 и 1,5.

Табл. 2-5 иллюстрируют процент разложения соли в определенные моменты времени.

В табл. 2 приводятся данные для соли CAM-nHCl.

В табл. 3 приводятся данные для соли CAM-nH SO.

В -табл. 4 приводятся данные для соли САМ 1,5HiS04-nHCl.

В табл. 5 приводятся данные для соли САМ 2НС1-H SO .

166

Остаточный САМ-процент в указанные моменты времени определяют способом, описанным ниже, и который обеспечивает максимальную точность измерений за счет того, что позволяет полностью отделить САМ от всех возможных продуктов разложения.

В связи с этим найдено, что используемый до настоящего времени способ, основанный на применении аналитической колонки ионообменной смолы Доуекс 50, не позволяет добиться полного отделения САМ от нзкоторьк продуктов разложения, и, в частности, от метилтиоаденозина, что приводит к ошибке в оценке стабильности САМ, которая была предполагаемой.

Предлагаемьй способ определения .. САМ основан на использовании жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД). Использованы следующие условия: колонка Партисил 10SCX - 2,5 250 мм, элюирующий растворитель 0,1 М муравьинокисльш аммоний с рН 4, содержащий 20% метанола для ЖХВД, поток 1 мл/мин; время удерживания САМ примерно 400 с.

Из данных табл. 2-5 следует, что САМ-соли обладают максимальной стабильностью в том случае, когда они содержат пять кислотных эквивалентов. Соли с четырьмя и шестью эквивалентами обладают достаточно хорошей стабильностью, в то время как более низкое число кислотных эквивалентов не имеет практического значения в силу значительной нестабильности получаемых солей.

Также очевидно, что стабильность имеет одинаковый характер независимо от применяемой кислоты, при условии, что это есть кислота с рК меньше 2,5.

Нельзя приготовить соли с кислотами, имеющими рК больше 2,5, содержащими 4-6 кислотных эквивалентов.

Аналогичным способом также определена стабильность для солей, которые .получают в присутствии лиофили- зирующего агента, указанного в примерах 3 и 4. Результаты приведены в табл. 6 и 7 (для солей САМ ЗНС и САМ 2, 5Н2;S04 ) . Отмечается резкое снижение содержания влаги при проведении лиофилизации в присутствии лио- филизирующего агента и соответствующее повьш1ение стабильности соли, получаемой таким путем.

Испытания фармакологических свойс солей САМ ЗНС и САМ-2,54,504 показали высокую активность и их токсичность, не зависящую от аниона, свя- занного с САМ. Установлено, что активность новых солей существенно зависит от способности САМ иона, выделяемого в организме, действующего как донор метильных групп, как при- родное вещество с большим числом трансметилазовых ферментов, которые катализируют важнейшие реакции белькового, жирового и глюцидного обмена

Важность новых солей обуславлива- ется тем, что они делают З-аденозил- метионин абсолютно стабильным при температуре вплоть до , тем самым позволяя Yloлнocтью использовать его трансметилирующую активность в человеческом организме без опасности образования токсичных продуктов разложения, которые отрицательно влияют на биологические процессы, активированные САМ.

Токсичность.

Острую токсичность определяли на мышах. Для обеих солей получены значения TOjo при пероральном приеме . больше 3 г/кг, при внутривенном вве- дении -1,1 г/кг.

Переносимость и хроническую токсичность определяли на крысах породы Вистар и Спрагью-Доули, давая им в течение 12 мес. в день по 20 иг/кг продукта. После прекращения эксперимента не было обнаружено патологических изменений в различных органах и системах.

На кроликах проведены тератогенны эксперименты. Не обнаружено никакого тератогенного действия или врожденных уродств у эмбрианов или утробного плода конечной стадии при введени солей формулы (I) в дозах, в десять раз превьш1ающих максимальные терапевтические дозы.

Внутривенное введение доз вплоть до 200 мг/кг не вызывало у кроликов никакого пирогенного проявления. Внутривенное введение 40 мг/кг у кроликов и крыс не приводило к изменени давления в сонной артерии, частоты сокращения сердца или дыхания, ни к изменениям электрокардиограммы,

Местная переносимость в случае внутримышечных инъекций, даже после повторения введения в течение 30- 60 дн, ив случае внутр ивенных инъекций в маргинальную вену внешнего уха кролика была очень хорошей.

Фармакологические свойства.

Проведенная на крысах полная серия испытаний показала, что новые соли формулы (I) оказывают очень значительное защитное и рассасывающее действие при гепаткческом стеатозе, вызванном гиперлипидной-гиперпротеино- вой диетой по Гандлеру, и стеатозе, вызванном острой алкогольной интоксикацией и другими токсическими веществами даже в том случае, когда вво дитсд доза 10 мг/кг САН.

При экспериментальной гиперлипе- мии у крыс, например, вызванной Тритоном S, новые соли демонстрируют очень значительную гиполипемическую активность, которая при используемьк дозировках (т.е. 10 мг/кг, выраженных IB САМ) была намного вьш1е, чем в случае других лекарственных препаратов, обладающих гиполипемической активностью.

У цыплят, у которых вызван атеросклероз с помощью диеты, богатой холестерином и фруктозой, парентеральное введение продуктов формулы (I) в дозах 10 мг/кг уменьшает холестаро- лемию и благоприятно изменяет поражения, которые обнаруживаются у контрольных птиц в отношении грудной и брюшной аорт и малых сосудов основания мозга.

Что касается фосфолипидного обмена, то было экспериментально установлено, что у крыс имеет место увеличение в тканях печени количества фос- фатидилхолина при некомпенсированном стеатозе. Был определен полный прирост фосфатидилхолина при расходе альфа протеинов крови при экспериментальшВГ нарушениях, вызванных соотношением бета к альфа-липопротеинов.

Все эти эксперименты отчетливо свидетельствуют о лечебном эффекте новых солей формулы (I) при нарушения жирового обмена.

Дополнительной серией экспериментов на крысах было показано, что введение доз 1 мг/кг вызывает накопление запаса гликогена в крови и мышцах, что демонстрируется как гистохимическими методами, так и количественными оп ределениями. При экспериментальном диабете, вызванном аллоксаном, количество инсулина, которое требуется ввести для возвращения к норме вели

чины гликемии, значительно уменьшает ея путем введения 0,5 мг/кг САМ .

Эти серии экспериментов отчетливо иллюстрируют положительное действие йовых соединений формулы (I) на глю- 1(идный обмен,

I Крыс, у которых экспериментально вызвана гиподиспротеинемия, обрабатывали количествами 10 мг/кг САМ Установлено, что указанный продукт озвращает все показатели протеинеми до нормальных значений в основном пу ем увеличения содержания альбумина и таким образом иллюстрируя значител иую протеиновую анаболическую активность.

Соединения формулы (I) проявляют особенную активность в части защиты 1ечени. Защитная активность была оп- ; еделена при внутримьшечном введении лри дозе 20 мг/кг соли САМ за 5 мнн до внутрибрюшинной инъекции 710 мг/к ,1цетаминофена мыши.

Полученные результаты приведены в табл. 8.

Результаты показьгаают сущеетвен- 1ое увеличение защиты по сравнению с ; Двойными солями дисульфат-ди-п-толу- эл сульфонатов.

I NH2

N

V

К

н сн

сн-CH-CH-CH-CH2-S-CH, СНг-СН-СОО пНХ

II ф I

он онNH.

где X - кислотный эквивалент сильной минеральной кислоты с рН меньше 2,5; п 4, 5 или 6,

отличающийся тем, что концентрированный водный раствор технической 8-аденозш1метиониновой соли, полученной путем лизиса дрожжевых клеток, обогащенных S-аденозил- метиониновой солью по методу Шленка, очищгаот, после доведения рН раствора до 6-7 пропусканием через слабо кислотную ионообменную смолу, элюируют разбавленным раствором кислоты НХ, например 0,1 н. раствором кислоты, титруют элюат и доводят количество

Эти и другие аналогичные эксперименты иллюстрируют лечебное действие новых продуктов формулы (I) при нарушениях протеиодного обмена.

Суммируя сказанное, можно утверждать, что на основе описанных фармакологических экспериментов и многих других данных,которые показывают актив ность новых соединений формулы (1),изученных на всех уровнях организма человека, активность новых продуктов клинически установлена в гепатологии в острой и хронической гепати- ческой интоксикации, в нейрологии в .качестве антидепрессантов и в остеологии в случае ревматоидных артритов.

Новые соли формулы (I) могут вводиться перорально или путем внутримышечных инъекций, или путем внутривенных инъекций. Другими приемлемыми формами применения являются свечи, жидкости для глазных введений, аэрозоли или формы для местного употребления.

Формула изобретения

кислоты до строго стехиометрической. пропорции по отношению к присутствую- щей S-аденозилметиониновой соли прибавлением промышленного концентриро- ванного раствора данной кислоты или титрованием этого раствора сильно основной ионообменной смолой в ОН-фор- ме, упаривают элюат до достижения концентрации S-аденозилметиониновой соли формулы I 50-100 г/л и лиофили- зируют его.

in

СП

т

03

13

.11

21,5

32

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

14

3

14

1720

4,55

1720

15

Без лиофилнзирующего агента

С маннитом (ЮОгСАМ + 120 г маннита)

С Аэросилем

(100 г САМ% 120 гАэросиля)

Табл

Процесс лиофилизации

Без лиофилизирующего агента

,4-.С маннитом (100 г САМ + + 120 г маннита)

С Аэросилем (100 г

+ 100 г Аэросиля) 0,2

Таблица 5

16

Разложение при 45°С спустя 360 дней.

,4-. +

0,1

17

1433416 Таблица 8

Соль для защиты

САМ-Дисульфат ди-п-толуол сульфЬнат (структурный

аналог)

Контрольная группа

18

Смертность животных, %