Способ получения солей производных S-аденозилметионина Советский патент 1987 года по МПК C07H19/167 A61K31/7076 

k

A- n Н A CD

1rjA0592

Изобретение относится к химии, бо- 8-аденояи,чметионнн.5 (SAM) fOiiieu фор- лее конкретно к способу получения но- мулы вых соединений - солей производных,

H-i

О S

N N

он ОН 0

где R - линейный или разветвленный

алкильный радикал с 1-6 атомами углерода-, А - эквивалент кислоты с рКа 2,5;

п 0-4.

Целью изобретения является получение новых биологически активных соединений, обладающих более высокой

сн.

)5

н

смесь фильтруют. Затем раствор титруют .

Для получения молярного отношения метилового сложного эфира SAM и серной кислоты 1:2 добавляют достаточное количество концентрированной серной кислоты, а затем раствор лиофилизуют.

Получают 820 г метилового сложного

стабильностью и повышенной способно- эфира SAM 66,8% предлагаемой формулы стью проходить через клеточные мем- (R CHj,)H, 31,7%, HjO 1,5%, что браны.соответствует выходу 54,7%.

Пример 1. Количество сульфата При анализе с помощью высокоэффек- SAM, соответствующее 1 кг (2,732 моль) у тивной жидкостной хроматографии (колонка Партисил-10 SCX, муравьино- кислый аммоний 0,1 М, рН А, 20% меионов SAM, растворяют в 20 л метанола, содержащего 4,6 мас.% концентрированной серной кислоты. Раствор кипятят с обратным холодильником в течение 16 ч, охлаждают и разбавляют 20 л дистиллированной воды. Полученный раствор пропускают через колонку с Амберлитом-IRA-93, предварительно активированным 2 н. NaOH и промытым до рН 3. Используют 15 л смолы.

Элюат фильтруют и промывают дистиллированной водой. Метанол выпаривают в вакууме. Полученный раствор кипятят в течение 20 мин для удаления следов непрореагировавшего SAM, а затем охлаждают.

Подготавливают колонку с Амберли- том IRC-50 в Н -форме, содержащую 40 л смолы, активированной 100 л 0,5 н. HjSO, промытую до нейтральной реакции. Предварительно полученный раствор нейтрализуют до рН 6,5 2 н. NaOH, пропускают через колонку со скоростью 40 л/ч, затем промывают 40 л Н,0.

Через колонку пропускают 0,1 н. раствор уксусной кислоты до (около 200 л), а затем пропускают 40 л дистиллированной воды.

Проводят элюирование 60 л 0,1 н. . Элюат концентрируют в вакууме (, 30 мм рт. ст.), приблизительно до 10 л, добавляют 50 г активированного древесного угля и полученную

танол, скорость потока 1 мл/мин) про30

дукт дает один живания 580 с.

пик с временем удерСпектр УФ: рН 4, максимум поглощения при 258 нм - 14040J рН 1, .. максимум поглощения при 256 нм - f 13500.

35 Спектр ЯМР, м.д.: 3 (синглет -СН5-групп), 3,7 (синглет R-C-O-CHj6групп).

Если перед лиофилизацией устанав40 ливают соотношение метилового сложного эфира SAM и серной кислоты 1:1,5 или 1:2,5 (молекулярное соотношение), а затем раствор лиофилизируют, получают соответственно соли - метиловьй

45 СЛОЖНЫЙ эфир SAM 1,5 хО,5 HjO, , метиловый сложный эфир ,5 X 0,5 Н,;0.

50

55

Если колонку IRC-50 элюируют вместо серной кислоты соляной, получают следуклцие соли: метиловый сложный эфир SAM 3HC1- 0,5 , метиловый слож ный эфир ,5 , метиловый сложный эфир SA 1 5HC1 0,5 .

Аналогичным образом, используя ме- тансульфокислоту, получают соответствующие метансульфонаты,

Аналитические данные для этих солей приведены в табл. 1.

н

смесь фильтруют. Затем раствор титруют .

Для получения молярного отношения метилового сложного эфира SAM и серной кислоты 1:2 добавляют достаточное количество концентрированной серной кислоты, а затем раствор лиофилизуют.

танол, скорость потока 1 мл/мин) про30

дукт дает один живания 580 с.

пик с временем удерСпектр УФ: рН 4, максимум поглощения при 258 нм - 14040J рН 1, .. максимум поглощения при 256 нм - f 13500.

35 Спектр ЯМР, м.д.: 3 (синглет -СН5-групп), 3,7 (синглет R-C-O-CHj6групп).

Если перед лиофилизацией устанав40 ливают соотношение метилового сложного эфира SAM и серной кислоты 1:1,5 или 1:2,5 (молекулярное соотношение), а затем раствор лиофилизируют, получают соответственно соли - метиловьй

45 СЛОЖНЫЙ эфир SAM 1,5 хО,5 HjO, , метиловый сложный эфир ,5 X 0,5 Н,;0.

Если колонку IRC-50 элюируют вместо серной кислоты соляной, получают следуклцие соли: метиловый сложный эфир SAM 3HC1- 0,5 , метиловый сложный эфир ,5 , метиловый сложный эфир SA 1 5HC1 0,5 .

Аналогичным образом, используя ме- тансульфокислоту, получают соответствующие метансульфонаты,

Аналитические данные для этих солей приведены в табл. 1.

П р И М е р 2. Повторяют проце- ДУРУ описанную в примере 1, за тем исключение, что исходные соединения кипятят с обратным холодильником в течение 14 ч, используя абсолютный этанол, содержащий 4,6 мас.% серной кислоты.

Этиловый сложный эфир SAM получают в количестве 840 г в виде этилового сложного эфира SAM-2HjS(VO,5 состава, %: SAM-этиловый э фир (формула I, R - 67,6; HjSOt 31; 1,4.

максимум поглоще- 14,040; рН 1, при 256 нм

0,9 (триплет.

УФ-спектр: рН 4, максимум поглоще- 15 ния при 258 нм Е « 14040; рН 1, максимум поглощения при 256 нм « 13300.

Спектр ЯМР, М.Д. 1,25 (триплет.

УФ-спектр: рН 4, ния при 258 нм f максимум поглощения Б 13,500.

Спектр ЯМР, м.д.

характерный для R-CHj-группы); 3(син- глет, характерный для 8-СН5-группы) , 4,1 (квадруплет, характерный для 10 К-С-О-СН -К-группы).

О

При анализе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в условиях примера 1 продукт дает один пик се временем удерживания 650 с.

В описанных условиях получают серию солей, аналогичных приведенным в примерах 1 и 2.

Используя н-пентанол и н-гексанол

R-CH,-групп); 3 (синглет, S-CHj групп); 20 вместо бутанола получают н-пентильные

,4,2 (квадруплет К-С-О-СН -Н группы).

О Выход 55%.

При исследовании с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в условиях примера 1 продукт дает один пик со временем удерживания 600 с.

По методу, приведенному в примере 1, возможно получение целого ряда солей: этиловый сложный эфир SAM х X 1j5 HjSO г 0,5 HjOj этиловый сложный эфир SAM 2,5 HiS04 0,5 , этиловый сложный эфир ,5 , этиловый сложный эфир ВАМ-4 НС1 х .к 0,5 этиловый сложный эфир SAM 5 HCl.0,5 HjO; этиловый сложный эфир ЗАМ ЗСНзВОзН «0,5 HjO; этиловый сложный эфир СНз50зН 0,5 этиловый сложный эфир 8АМ 5СНз80|Н х X 0,5 Hjp.

Спектры УФ и ЯМР всех этих солей идентичны спектрам приведенных ранее солей.

П р и м е р 3. Повторяют процедуру, описанную в примере 1 используя н-бутанол, содержащий 4,6 мас.% серной кислоты и нагревая исходную смесь с обратным холодильником в течение 10 ч.

V

Вначале получают суспензию, которая превращается в прозрачней раствор после кипячения с обратным холодильником.

смесь сложного н-бутнло- вого эфира SAM следующей формулы: н-бутиловый сложный эфир SAM 2 H. X 0,5 HjO.

35

и н-гексильные сложные эфиры.

В табл. 2 даны аналитические данные для сложных эфиров .SAM, полученных в примерах 2 и 3.

25

П р и м е р 4. Количество сульфата SAM, эквивалентное 1 кг ионов SAM, растворяют в 20 л изопропилового спирта, содержащего 2Z (по объему) кон30 центрированной серной кислоты. Раствор нагревают в течение 16 ч. Полученную реакционную смесь обрабатывают смолой Амберлит, как в примере 1. лучают изопропиловый эфир SAMi 2H2SO x- X 0,5 HjO 855 г, состав, %: изопропиловый сложный эфир SAM, 68; серная кислота 30; 55; вода 1,45.

П р и м е р 5. Количество сульфата ЗАМ, соответствующее 1 кг ионов SAM,

40 растворяют в 20 л изобутилового спирта, содержащего 2% (по объему) концентрированной серной кислоты. Раствор кипятят с обратным холодильником 16 ч. Полученную реакционную смесь

45 обрабатывают смолой Амберлит как в примере 1. Получают изобутиловый сложный эфир SAM 2 H2S04 0,5 860 г, состав, изобутиловый эфир

SAM, 68,5; серная кислота 30,1; вода 1,4.

Стабильность полученных солей эфи ров производных S-аденозилметионина сравнивают со стабильностью соли S- аденозилметионина.

В табл. 3 приведена стабильность водных растворов солей эфиров SAM (п 3) при различных рН.

рН водных растворов устанавливают добавлением определенного количества

50

55

максимум поглоще- 14,040; рН 1, при 256 нм

0,9 (триплет.

15

40592

УФ-спектр: рН 4, ния при 258 нм f максимум поглощения Б 13,500.

Спектр ЯМР, м.д.

характерный для R-CHj-группы); 3(син- глет, характерный для 8-СН5-группы) , 4,1 (квадруплет, характерный для 10 К-С-О-СН -К-группы).

О

При анализе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в условиях примера 1 продукт дает один пик се временем удерживания 650 с.

В описанных условиях получают серию солей, аналогичных приведенным в примерах 1 и 2.

Используя н-пентанол и н-гексанол

20 вместо бутанола получают н-пентильные

5

и н-гексильные сложные эфиры.

В табл. 2 даны аналитические данные для сложных эфиров .SAM, полученных в примерах 2 и 3.

5

П р и м е р 4. Количество сульфата SAM, эквивалентное 1 кг ионов SAM, растворяют в 20 л изопропилового спирта, содержащего 2Z (по объему) кон0 центрированной серной кислоты. Раствор нагревают в течение 16 ч. Полученную реакционную смесь обрабатывают смолой Амберлит, как в примере 1. лучают изопропиловый эфир SAMi 2H2SO x- X 0,5 HjO 855 г, состав, %: изопропиловый сложный эфир SAM, 68; серная кислота 30; 55; вода 1,45.

П р и м е р 5. Количество сульфата ЗАМ, соответствующее 1 кг ионов SAM,

0 растворяют в 20 л изобутилового спирта, содержащего 2% (по объему) концентрированной серной кислоты. Раствор кипятят с обратным холодильником 16 ч. Полученную реакционную смесь

5 обрабатывают смолой Амберлит как в примере 1. Получают изобутиловый сложный эфир SAM 2 H2S04 0,5 860 г, состав, изобутиловый эфир

SAM, 68,5; серная кислота 30,1; вода 1,4.

Стабильность полученных солей эфи ров производных S-аденозилметионина сравнивают со стабильностью соли S- аденозилметионина.

В табл. 3 приведена стабильность водных растворов солей эфиров SAM (п 3) при различных рН.

рН водных растворов устанавливают добавлением определенного количества

0

5

, Полученные результаты демон- стрируют более высокую стабильность солей эфиров SAM по сравнению с SAM. Способность солей эфиров SAM проходить через клеточные барьеры характеризуется данными, приведенными и табл. 4.

В опыте in situ (кишечные мешочки) 2 мг каждого испытуемого продукта в 1 мл физиологического раствора помещают в кишечные мешочки крысам под эфирной анестезией. Крысы погибают через 2 ч, и остаточное содержание мешочка (стенка + содержание) анализируют. Определенное таким образом количество мигрировавшего продукта приводится в т абл. 4 (%) от исходного количества в мешочке.

В других опытах используют кусочки Q ющими действиями при гепатитных стеавывернутои кишки, которые выдерживают при 37°С (по методу Кребса-Риндера) в растворе с внешней концентрацией исследуемого соединения 10 М.

Количество абсорбированного продукта, подтвержденное анализом, приводится в табл. 4 в виде удельной ветозах, вызванных гиперлипид-гипербел- ковой диетой по способу Хандлера, и при стеатозах, вызванных острыми алкогольными отравлениями и другими

25

личины, т.е. моль/ч/мг ткани. Соли всех соединений получают с одинаковым количеством .

Соединения (I) хорошо поглощаются в кишечном тракте, причем более интенсивно, чем сульфат SAM, что позволяет достигать в плазме при оральном применении значительно более высоких концентраций действующего вещества, чем при использовании сульфата SAM.

Токсичность. Острую токсичность определяют на мышах. Во всех получают следующие значения: ЛД при оральном лечении более 3 г/кг, при внутривенном введении более 1 кг. I

Тесты на переносимость и хроническую токсичность проводят на крысах щтамма Wistar и Sprague - Dowley, вводя им 20 мг/кг в день исследуемого соединения в течение 12 мес. По окончании обработки в различных органах и системах не обнаружено патологических отклонений.

На кроликах проводят тесты терато- генезиса. При введении доз солей, в 10 раз превышающих терапевтическую максимальную дозу, не наблюдалось те- ратогенического действия или злокачественных новообразований на зародьш1ах или выросших плодах.

дозах 10 мг/кг SAM .

При экспериментальной гиперлипемии у крыс, например, вызванной Tritons, соединения (I) продемонстрировали 30 чрезвычайно заметную гиполипемическую активность, которая в дозах 10 мг/кг (ионов SAM) значительно превосходила другие препараты с гиполипемической активностью.

У цыплят с атеросклерозом, вызванным с помощью диеты, обогащенной холестерином и фруктозой, при парэнте- ральном введении соединений (I) в дозах 10 мг/кг снижалась холестероле- случаях и благоприятно модифицировались повреждения по сравнению с контрольными экземплярами по отношению к торакальной и абдоминальной аорте и мелким сосудам энцефалической основы.

35

45

50

Что касается фосфолипидного метаболизма, экспериментально бьшо обнаружено, что имеется увеличение фосфа- тидилхолина в гепатитной ткани крыс при некомпенсированных стеатозах. Четкое повышение фосфатидилхолина было также определено в опытах гема- тических о -липопроте инов в экспериментальных альтерациях, вызванных /з/о -липопротеиновыми отношениями.

Во всех этих тестах имеются четкие указания на лечебное действие соединений (I) при нарушениях липидного метаболизма.

При внутривенном введении доз вплоть до 200 мг/кг у кроликов не обнаруживалось пирогенных явлений.

При внутривенном введении кроликам и крысам 40 мг/кг не наблюдалось изменений в каротидном давлении, частоте сердечных и дыхательных сокращений или на электрокардиограмме. -Локальная переносимость внутримышечных инъекций даже после повторения вве);ений в течение 30-60 дней и внут- риве.нных инъекдий в маргинальную вену наружного уха кроликов была превос- ходной.

Фармакология. Полная серия тестов, проведенных на крысах, продемонстрировала,, что соединения (I) обладают весьма заметными защитными и разрешатозах, вызванных гиперлипид-гипербел- ковой диетой по способу Хандлера, и при стеатозах, вызванных острыми алкогольными отравлениями и другими

5

0

Что касается фосфолипидного метаболизма, экспериментально бьшо обнаружено, что имеется увеличение фосфа- тидилхолина в гепатитной ткани крыс при некомпенсированных стеатозах. Четкое повышение фосфатидилхолина было также определено в опытах гема- тических о -липопроте инов в экспериментальных альтерациях, вызванных /з/о -липопротеиновыми отношениями.

Во всех этих тестах имеются четкие указания на лечебное действие соединений (I) при нарушениях липидного метаболизма.

Следующую серию тестов проводили

на крысах, и она продемонстрировала,

что введение доз 1 мг/кг вызывает

аккумуляцию гликогенных резервов на гепатитном и мускульном уровнях, что демонстрируется, как гистохимическими методами, так и количественными измерениями. В экспериментальных диабетах, вызванных аллоксаном, количест- ю аналь.гетической активности соединений во инсулина, необходимого для возвра- (I) проводились по методу Уинтера пу- щения гликемических значений к нормальным, значительно снижалось при введении 0,5 мг/кг .

Эта серия экспериментов продемон- 15 стинк (метод Янссена и Ячено) . стрировала отчетливое положительное

действие соединения (I) на глюцидный Сульфат SAM при оральном применении не обладал какой-либо противовоспалительной и болеутолящей активно- гиподиспротеинемией обрабатывали про- 20 стью. Кроме того, противовоспалитель- изводными SAM в дозе 10 мг/кг. Обна- ная и болеутоляющая активность сое- ружено, что указанные продукты возность соединений (I) при нарушениях протидного .метаболизма.

Соединения (I) обладают также значительной противовоспапительной и анальгетической активностью по сравнению с известными.

Испытания противовоспалительной и

тем оценки их воздействия на edema, вызванную каррагенином у крыс, и реакции на ожог у мьпией на горячей пламетаболизм.

Крыс с экспериментально вызванной

динений (I) вьппе, чем соответствующая активность сульфата SAM при внутри- мьшечном применении.

вращают полные протеинемичные значения к нормальным при существенном повышении уровня альбумина и тем самым демонстрируют заметную протеиновую анаболическую активность.

Эти и другие аналогичные тесты продемонстрировали лечебную эффектив25

динений (I) вьппе, чем активность сульфата SA мьшечном применении.

Формула изоб

Способ получения со 8-аденозилметионина об

N42 N V- N

Ц.Д j)

IJ N

CH -S-CHiCH CHA-tiUA

OH

0аналь.гетической активности соединений (I) проводились по методу Уинтера пу-

ность соединений (I) при нарушениях протидного .метаболизма.

Соединения (I) обладают также значительной противовоспапительной и анальгетической активностью по сравнению с известными.

Испытания противовоспалительной и

аналь.гетической активности соединений (I) проводились по методу Уинтера пу-

тем оценки их воздействия на edema, вызванную каррагенином у крыс, и реакции на ожог у мьпией на горячей плаСульфат SAM при оральном применении не обладал какой-либо противовоспалительной и болеутолящей активно- стью. Кроме того, противовоспалитель- ная и болеутоляющая активность сое-

динений (I) вьппе, чем соответствующая активность сульфата SAM при внутри- мьшечном применении.

Формула изобретен И я

Способ получения солей производных 8-аденозилметионина общей формулы

где R - линейный или разветвленный

-алкил-, A - эквивалент кислоты с рКа

2,5v п 0-4,

отличающийся тем, что, раствор соли S-аденозилметионина в соответствуюцем спирте ROH, где R обратным холодильником, полученный продукт очищают пропусканием реакционной смеси через колонку с ионооб- 40 ной смолой в Н -форме, элюируя разбавленным водным раствором кислоты НА, а к элюату после концтрирования добавляют кислоту НА в количестве.

необходимом для достижения заданной

а 1ки ьньй радйкалГ определенный вьппе, 45 величины п, полученную соль производ- Ьодержащем 1-3% концентрированной ного S-аденозилметионина выделяют ли- серной кислоты по объему, кипятят с офильной сушкой.

обратным холодильником, полученный продукт очищают пропусканием реакционной смеси через колонку с ионооб- ной смолой в Н -форме, элюируя разбавленным водным раствором кислоты НА, а к элюату после концтрирования добавляют кислоту НА в количестве.

14,79 14,78 14,08 14,01 247

13,61 13,73 15,56, 15,61 228

16,82 16,72 211

6,04 6,01 265

5,64 5,65

248

5,31 5,29 , 233

11,85 11,87 18,05 17,99 198

10,48 10,49 19,88 19,86 174

9,32 9,29 21,31 21,35156

Поглощанхцая способность 1%-ного водного раствора соединения (I) толщиной 1 см при рН 4 в УФ Свете.

Таблица2

SAM этиловый сложный

эфир 2HjSO -0,5

SAM н-пропиловый

сложный эфир 2HjSO X

X 0,5 HjO

Т а б л и ц а 1

14,01 247

15,61 228

16,72 211

6,01 265

5,65

248

5,29 , 233

17,99 198

19,86 174

21,35156

54.7 54,7

54,7 55,6 55,6 55,6

54,3 54,3 54,3

13,27 15,19 15,18 222 49,5

13,02 14,86 14,85 217 46,3

SAM н-бутиловый сложный эфир X X 0,5 HjO

SAM н-пентиловый сложный эфир 2Н2 SO4 X X 0,5 Н,0

SAM н-гексиловый сложный эфир 2HjS04 X X 0,5 HjO

Продолжение табл.2

14,55 14,52 213 41,1

14,25 208 38,4

13,95 13,93 204 35,3

13

1340592

Таблица

U

ТаблицаЗ

Изобретение касается замещенных Сахаров, в частности солей производных S-аденознлметионина (AM) общей формулы j-S(CHj)-C Hjгде К - -СН.0-СН2,К;Н(КН2)-С(0)-ОК-А п НА; R-нор- - мальный шш изо-С -С -алкил; А - эквивалент кислоты с рКа 2,5;п - целое число 0-4, которые используют как биологически активные соединения, способные проходить через клеточные мембраны. Цель - создание более активных и стабильных соединений указанного класса. Синтез AM ведут из раствора соли 8-аденозш1метионина в соответствующем алкильном спирте, содержащем 1-3 об.% конц. H,SO, при кипячении. Затем ведут очистку полученного продукта пропусканием его через ионообменную смолу в { форме и элюированием водной кислотой. К злюату после концентрирования добавляют кислоту НА в количестве, необходимом для получения нужной соли ().Вьщеление последней ведут лиофильной сушкой. Испытания AM показь вают значительную противовоспалительную и анальгетическую активность, которые отсутствуют у известных аналогов. AM проявляют защитные и разрешающие действия при гепатитных стеатозах, вызванных алкогольным отравлением (глюцидный и протидный метаболизм). 5 табл. СО