Изобретение относится к молекулярной биологии и касается способа изготовления матрицы для детектирования мисматчей, применяемой в биотехнологии, например, в процессе определения нуклеотидной последовательности ДНК.
Известен способ изготовления матрицы для детектирования мисматчей, содержащей набор олигонуклеотидов заданной длины А, Т, G, C, C, T,(PCT/GB 89/00460, 1989).
Способ состоит в том, что олигонуклеотиды, входящие в выбранный набор, синтезируют непосредственно на поверхности стеклянной подложки путем последовательного маскирования участков поверхности подложки с использованием полосок разной ширины из силоксанового каучука. Маскирование выполняют, например, следующим образом.
Первый набор из четырех оснований А, Т, G, C получают, накладывая четыре широких полоски на прямоугольную стеклянную пластину (подложку).
Второй набор получают, накладывая четыре полоски, равные по ширине первым и ортогонально расположенные относительно них. Получают матрицу, включающую набор из 16 динуклеотидов, затем накладывают третий и четвертый слои каждый из четырех узких полосок, ширина которых составляет 1/4 от ширины полосок первого слоя.
При этом каждый слой из четырех узких полосок находится в пределах одного слоя из более широких полосок. В итоге получают матрицу, содержащую набор из 256 тетрануклеотидов.
Процесс повторяют, накладывая каждый раз два слоя с ортогонально расположенными полосками, которые по ширине составляют 1/4 от ширины полосок двух предыдущих слоев. Каждый прибавляемый слой удлиняет олигонуклеотиды на одно основание и увеличивает в четыре раза количество уникальных олигонуклеотидных последовательностей в наборе.
Размеры полученных этим способом матриц определяются шириной полосок. При использовании самых узких полосок шириной примерно 1 мм матрица, содержащая набор из 256 олигонуклеотидов, занимает площадь 256 мм2. При увеличении количества олигонуклеотидов в наборе размеры матрицы соответственно увеличиваются, что делает ее неудобной в использовании, в частности становится затруднительным одновременный контроль всех ее элементов, особенно при реализации метода с использованием флюоресцентных меток.
Кроме того, описанный способ изготовления матрицы за счет большего числа последовательных операций требует длительного времени для своего осуществления.
Известен, кроме того, способ изготовления матрицы для детектирования мисматчей, содержащей набор олигонуклеотидов заданной длины, состоящий в том, что на жесткую подложку наносят сплошной слой геля, затем удаляют часть этого слоя и формируют в соответствии с заданной топологией матрицы на поверхности подложки множество по числу олигонуклеотидов в наборе участков геля, отделенных один от другого промежутками, после чего на каждом из полученных участков геля закрепляют по одному олигонуклеотиды из набора АТТGCC. синтезированные предварительно, (РСТ/RU 92/00052, 1992). При осуществлении известного способа частичное удаление слоя геля в местах расположения промежутков осуществляют механическим скрайбированием по шаблону.
Этот способ позволяет изготавливать матрицы с меньшими затратами времени, поскольку микродозы олигонуклеотидов, синтезированных заранее, закрепляют на всех участках слоя геля одновременно за одну операцию.
Кроме того, матрица, элементы которой сформированы объемными участками слоя геля, характеризуется при той же мощности выходного сигнала меньшими размерами по сравнению с матрицей, элементы которой сформированы путем синтеза олигонуклеотидов непосредственно в околоповерхностном слое подложки.
Однако формирование участков и промежутков в слое геля механическим скрайбированием не позволяет получать участки со стороной меньшей 100 мкм. Дальнейшая минимизация размеров приводит, как правило, к механической деструкции геля на краях участков, к искажению топологии матрицы, участки получаютcя со скругленными углами, возможно отслаивание геля от подложки, что сопровождается снижением уровня или даже потерей полезного сигнала.
В основу изобретения положена задача создать способ изготовления матрицы для детектирования мисматчей, в котором бы операция формирования участков в слое геля в соответствии с топологией матрицы осуществлялась таким образом, чтобы стало возможным получить эти участки с размером стороны ≈10-50 мкм с высокой точностью и надежным закреплением их на подложке, что позволило бы, в свою очередь, миниатюризировать матрицу при одновременном увеличении количества ее элементов.
Эта задача решается тем, что в способе изготовления матрицы для детектирования мисматчей, содержащей набор олигонуклеотидов заданной длины, состоящем в том, что на жесткую подложку наносят сплошной слой геля, затем удаляют часть этого слоя и формируют в соответствии с заданной топологией матрицы на поверхности подложки множество по числу олигонуклеотидов в наборе участков геля, отделенных один от другого промежутками, после чего на каждом участке геля закрепляют по одному олигонуклеотиды из набора, согласно изобретению, перед нанесением слоя геля на подложку в местах расположения промежутков изготавливаемой матрицы наносят промежуточный подслой вещества, поглощающего лазерное излучение, гель и материал подложки выбирают по существу прозрачными для лазерного излучения и удаление части cлоя геля осуществляют облучая сплошной слой геля лазерным пучком с экспозицией, обеспечивающей испарение геля в местах, расположенных над подслоем поглощающего вещества одновременно с веществом подслоя.
Предпочтительно в качестве вещества, поглощающего лазерное излучение использовать алюминий.
При этом желательно толщину промежуточного подслоя выбирать пропорциональной толщине слоя геля. При этом под пропорциональной мы подразумеваем толщину, которая достаточна для обеспечения испарения при облучении слоя геля в местах промежутков, но исключает возможность термической деструкции поверхности подложки и кромок участков геля, которые остаются после облучения.
Способ изготовления матрицы для детектирования мисматчей, осуществленный в соответствии с настоящим изобретением, позволяет получать матрицы со стороной участков ≈10-30 мкм с высокой точностью, отличается высоким быстродействием и не требует для своего осуществления конструктирования дополнительного оборудования. Способ, согласно изобретению, может быть реализован с привлечением оборудования широко применяемого в производстве микроэлектронных деталей и приборов.
На фиг. 1 изображена в изометрии матрица для детектирования мисматчей; на фиг. 1 матрица в изометрии в процессе изготовления, после нанесения промежуточного подслоя; на фиг. 3 то же, что и на фиг. 1, матрица в процессе изготовления, в момент облучения слоя геля лазерным пучком, поперечный разрез.
Матрица для детектирования мисматчей (фиг. 1) содержит жесткую подложку 1, в данном случае прямоугольную стеклянную пластину, на поверхности которой в соответствии c заданной топологией матрицы закреплено множество участков 2, отделенных один от другого промежутками 3. Поверхность каждого участка 2 имеет преимущественно форму квадрата, а сами участки 2 выполнены из геля, преимущественно полиакриламидного. Участки 2 являются элементами матрицы и в тело каждого из них иммобилизованы олигонуклеотиды заданной длины из выбранного набора, причем в каждый участок 2 иммобилизованы олигонуклеотиды строго одного типа.
На химически обработанную рабочую поверхность подложки 1 в местах расположения промежутков изготавливаемой матрицы наносят промежуточный подслой 4 (фиг. 2) вещества, поглощающего лазерное излучение. В качестве такого вещества может быть использован металл, например, Ni или Аl, предпочтительно Аl.
Химическую обработку проводят с целью подготовки рабочей поверхности подложки 1 для нанесения на нее качественной пленки вещества, поглощающего лазерное излучение. Например, если в качестве такого вещества выбран алюминий, поверхность стеклянной подложки отмывают перекисно-аммиачной смесью и затем промывают в ванне с деионизированной водой.
Формирование фигурного подслоя 4 может быть осуществлено в два этапа: нанесение на отмытую подложку 1 сплошной металлической пленки алюминия и фотолитография по металлической пленке с учетом заданной топологии матрицы.
Нанесение пленки алюминия можно выполнить, например, методом термического вакуумного испарения из резистивных испарителей. Толщина напыленного подслоя 4 предпочтительно составляет 0,1-0,3 мкм.
Метод фотолитографии по металлу широко описан в технической литературе и может быть применен без каких-либо особенностей.
Затем на подложку 1 с фигурным подслоем 4 вещества, поглощающего лазерное излучение, наносят сплошной слой 5 (фиг. 3) геля. При этом гель и материал подложки 1 выбирают по существу прозрачными для лазерного излучения. Для этой цели подходящим является полиакриламидный гель или агарозный гель. Предпочтительным является использование полиакриламидного геля и стеклянной подложки.
Для обеспечения лучшей адгезии полиакриламидного геля и образования ковалентной связи между гелем и поверхностью стекла подложку покрывают слоем Bind-Silane (гаммаметакрилоксипропилтриметоксисилан), выдерживают ≈30 мин, удаляют этот слой с помощью подходящего растворителя, промывают подложку деионизированной водой и высушивают струей газообразного азота или на воздухе.
Тонкую пленку полиакриламидного геля на поверхность стеклянной подложки наносят путем заливки раствора геля в капиллярный зазор, образованный между подложкой и покровным стеклом, поверхность которого, обращенную к подложке, предварительно обрабатывают с целью придания ей гидрофобных свойств.
Подложку и покровное стекло, между которыми помещены фторопластовые прокладки (толщиной 20 мкм), сдавливают зажимами и в зазор подают приготовленный полиакриламидный гель. Последний капиллярными силами втягивается в зазор и через некоторое время (5-10 мин) полимеризуется. Покровное стекло удаляют, подложку промывают деионизированной водой и сушат на воздухе. После этого осуществляют облучение сплошного слоя 5 геля лазерным пучком (на фиг. 3 показан вертикальными стрелками) с экспозицией, обеспечивающей испарение геля в местах 6, расположенных над подслоем 4 поглощающего вещества, а также испарение самого подслоя 4. В результате облучения на поверхности подложки 1 формируется множество участков 2 (фиг. 1) геля, отделенных один от другого промежутками 3, в которых гель и вещество подслоя 4 отсутствуют, а поверхность промежутков 3 является поверхностью стеклянной подложки 1.
В качестве источника лазерного излучения здесь может быть использован любой промышленно выпускаемый лазер, работающий в диапазоне длин волн 0,53; 0,55; 0,63; 0,69; 1,06 мкм.
В этом диапазоне длин волн коэффициент поглощения полиакриламидного геля и стекла не превышает долей процента, в то время как в этом же диапазоне коэффициент поглощения металлической пленки, в частности алюминиевой, существенно отличен от коэффициента поглощения геля и составляет десятки процентов.
Проникновение энергии излучения Е(х) в материалы описывается уравнением:
E(x) E0(1 R)e-ax, где Е0 энергия, падающая на поверхность,
R коэффициент отражения поверхности,
а коэффициент поглощения.
Количество энергии, поглощаемой в слое толщиной Δ х,
Δ Е Е0(1 R)ae-ax Δ x. Таким образом, поглощенная энергия максимальна на поверхности слоя и монотонно уменьшается с его глубиной. Большая часть энергии поглощается в приповерхностном слое толщиной 1/а. Для металлов значение а, как правило, составляет 104-105 см-1, поэтому для металлов толщина этого слоя составит 10-5-10-6 см.
Количество энергии лазерного излучения, которое может быть поглощено промежуточным подслоем 4 прямо пропор- ционально толщине Δ х этого подслоя и времени экспозиции до его испарения.
В то же время этой энергии должно хватить для полного испарения не только подслоя 4, но и части слоя 5 геля, расположенной над подслоем 4. При недостатке энергии происходит неполная деструкция подлежащей удалению части слоя 5 геля. При избытке этой энергии возможна термическая деструкция в поверхностном слое стеклянной подложки 1. Оптимальное количество энергии облучения, подводимой к слою 5 геля, можно выбрать, варьируя либо экспозицию при облучению, либо толщину подслоя 4.
Однако максимальное время экспозиции ограничено теплопроводностью стекла и геля и опасностью начала термодеструкции на подлежащей сохранению при облучении части слоя 5 геля. С учетом изложенного оптимальное количество энергии облучения обеспечивают выбором толщины Δ х промежуточного подслоя 4, пропорциональной толщине слоя 5 геля. После облучения слоя 5 геля, в результате чего на поверхности стеклянной подложки 1 получают множество участков 2 геля, отделенных один от другого промежутками, осуществляют иммобилизацию олигонуклеотидов в геле по известной технологии.
Для более четкого понимания существа настоящего способа ниже приводится конкретный пример изготовления заготовки матрицы на 65000 элементов.
П р и м е р. Брали предметное стекло микроскопа размером 45х45, толщиной 1,5 мм, отмывали его перекисно-аммиачной смесью, содержащей:
аммиак водный 1 ч. перекись водорода 1 ч. деионизированная вода 6 ч.
Время отмывки две ванны по 15 мин при температуре раствора 70-75оС.
После этого осуществляли промывку подложки в трехкаскадной ванне с проточной деионизированной водой. Затем сушили струей газообразного азота, после чего на всю поверхность обработанной подложки методом термического вакуумного испарения из резистивных испарителей напыляли сплошную пленку алюминия толщиной 0,2 мкм. На алюминиевую пленку методом центрифугирования наносили фоторезист, который после просушки экспонировали через фотошаблон с изображением изготавливаемой матрицы и получали на поверхности алюминиевой пленки защитный рельеф из фоторезиста, повторяющий рисунок фотошаблона. Травлением в 50%-ной ортофосфорной кислоте при температуре 60-70оС удаляли незащищенные фоторезистом участки алюминиевой пленки и получали на поверхности подложки фигурный промежуточный подслой из алюминия, который состоял из пересекающихся под прямым углом дорожек (промежутков) шириной 60 мкм, отстоящих одна от другой на расстоянии 30 мкм, при этом между дорожками было образовано множество квадратных участков 30х30 мкм незащищенных алюминиевой пленкой, расположенных упорядоченными рядами.
После этого на подложку наносили слой полиакриламидного геля толщиной 20 мкм. Подложку обрабатывали Bind-Silane и располагали дистанционно (с помощью прокладок толщиной 20 мкм) относительно нее покровное стекло, обработанное предварительно Repel-Silane (LKB) и покрытое тонким слоем Triton Х-100. Образованный зазор между ними заполняли раствором 8%-ного акриламида, 30:1 N, N'-метиленбисакриламида, персульфата аммония и ТЕМЕD и оставляли для полимеризации на 1 ч. При этом между предметным стеклом и подложкой формировался слой геля толщиной 20 мкм и с размерами, которые определяются размерами предметного стекла. После полимеризации покровное стекло снимали. Подложку со слоем полиакриламида обрабатывали в течение часа при комнатной температуре 50%-ным гидразином.
Приготовленный таким образом слой геля на подложке с промежуточным металлизированным подслоем, повторяющим полностью топологию изготавливаемой матрицы, направляли на лазерную обработку.
Для облучения использовали лазер со следующими характеристиками:
излучение на длине волны λ 1,06 мкм;
максимальная выходная мощность в режиме свободной генерации 1 кДж;
длительность импульса свободной генерации 3-5 мс;
активный элемент стекло с Nd+ +(630х15 мм);
частота следования импульсов 0,03 Гц;
охлаждение водяное.
Время экспозиции составляло 10-7 с.
В процессе облучения промежуточный подслой алюминия испарился полностью. За счет выделяющегося при испарении алюминиевой пленки тепла произошло испарение участков геля, расположенных над промежуточным подслоем. Участки геля, расположенные непосредственно на поверхности подложки остались неповрежденными, как и поверхность стеклянной подложки под испарившимся подслоем.
В результате была получена заготовка микроматрицы, содержащая на площади 1 см2 12000 участков геля 30х30 мкм, толщиной 20 мкм, отделенные один от дpугого промежутками шириной 60 мкм. Поверхность участков не имела повреждений, грани участков были четкими, отслаивания геля от поверхности подложки обнаружено не было. Поверхность самой подложки также не имела повреждений. В дальнейшем из полученной заготовки изготавливали микроматрицу для детектирования мисматчей путем иммобилизации олигонуклеотидов в геле.
Использование: относится к молекулярной биологии, к способам изготовления матриц для детектирования мисматчей. Сущность изобретения: способ состоит в том, что на жесткую подложку наносят промежуточный фигурный подслой вещества, поглощающего лазерное излучение. Конфигурация подслоя полностью соответствует топологии изготавливаемой матрицы. Затем на промежуточный фигурный слой наносят сплошной слой геля, при этом гель и материал подложки выбирают прозрачным для лазерного излучения. Облучают слой геля лазерным пучком с экспозицией, обеспечивающей испарение геля в местах, расположенных над подслоем поглощающего излучение вещества одновременно с самим этим веществом и на сформированных участках геля закрепляют по одному олигонуклеотиду из выбранного набора. 2 з.п. ф-лы, 3 ил.
| Автоматический огнетушитель | 0 |
|
SU92A1 |
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
