Способ определения нуклеотидной последовательности ДНК и устройство для его осуществления Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/68 C12N15/00 

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к определению последовательности нуклеотидов в ДНК методом гибридизации,

Известен ряд методов анализа нуклео- тидной последовательности и распознавания одиночных замен оснований при помощи гибридизации.

Распространенными являются методики, которые заключаются в том, что тестиру- емый фрагмент ДНК закрепляют на мембране и гибридизуют с меченными оли- гонуклеотидами.

Наиболее близким к заявляемому является способ и устройство для определения нуклеотидной последовательности ДНК,

включающий синтез олигонуклеотидов длиной от 8 до 20 нуклеотидов на стеклянной подложке-носителе, проведение гибридизации с радиактивно или флуоресцентно меченной тестируемой ДНК, определение наличия одиночных замен в исследуемой последовательности по анализу радиографического рисунка или интенсивности флуоресценции в отдельных точках.

Однако известный способ не обладает достаточно высокой чувствительностью, громоздок, так как требует в случае анализа даже фрагмента тестируемой ДНК проведе1- ния ряда последовательных гибридизаций и соответственно последовательного досин- тезирования используемой матрицы олиго

ю

4 О 00 00

со

нуклеотидов с шагом в одну букву во всех точках, где гибридизация не дает однозначной информации о последовательности, при этом каждый раз выбор новых оптимальных условий гибридизации (температуры, концентраций реагентов и т.д.) требует дополнительных значительных затрат при том, что упомянутые операции плохо или вообще не поддаются автоматизации.

Целью изобретения является повышение чувствительности, точности и воспроизводимости способа и устройства, упрощение определения известных точечных мутаций в нуклеотидной последовательности, снижв ние затрат и возможность.автоматизации процессов,

Поставленная цель в способе достигается тем, что меченную тестируемую ДНК гибридизуют со всем набором олигонуклео- тидных проб, иммобилизованных в ячейки геля-носителя, нанесенного на подложку, гибридизацию и отмывку проводят при одинаковой температуре,

Поставленная цель в устройстве достигается тем, что матрица представляет собой одинаковые участки геля толщиной 10-3.0 мкм, наибольшей длиной 25-100 мкм и с .расстоянием между участками, равным удвоенной наибольшей длине.

Способ осуществляют следующим образом.

Два предметных стекла, одно из которых предварительно обрабатывают Bind Silane, а другое - Repel Silane и покрывают тонким слоем TritonX-ЮО, устанавливают дистанционное помощью прокладок толщиной 10-30 м.км, образованный зазор в сэндвиче заполняют гелеобразующим раствором и оставляют до полного гелеоб- разования, После этого верхнее стекло снимают. Стекло со слоем геля обрабатывают 50%-ым раствором гидразина, подсушивают, часть геля удаляют так, что на поверхности стекла остаются одинаковые участки-ячейки геля с наибольшей длиной 25-100 мкм и промежутками между ними, равными удвоенной наибольшей длине. .Полученную поверхность обрабатывают в течение 2-5 мин Repel Silane, промывают спиртом, затем бидистиллятом и высушивают. Олигодезоксинуклеотиды, содержащие на 3 -конце 3-митилуридин, окисляют 1 мМ периодатом натрия в течение 10 мин - 1 ч при комнатной температуре, осаждают 10-ю объемами 2%-го LiCICM в ацетоне и растворяют в воде. Из необходимого набора в ячейки воздушно сухой матрицы наносят одинаковые по объему микродозы окисленных олигонуклеотидов, причем в каждую ячейку строго одного типа. При этом их концентрации в микродозах различны и подобраны так, что соответствуют одинаковой оптимальной температуре гибридизации и плавления совершенных дуплексов, образованных иммобилизованными .олигонуклео- тидами с фрагментами ДНК. Гибридизацию флуоресцентно или радиоактивно меченных фрагментов тестируемой ДНК проводят при оптимальной температуре и влажности, нанося ее на поверхность матрицы. Определяют наличие одиночных замен в исследуемой последовательности по анализу радиографического рисунка или интенсивности флуоресценции в отдельных ячейках.

На фиг.1 представлено устройство в

разрезе (позиция а) и вид сверху (позиция

б); стеклянная подложка 1, ячейки 2 геля, .

Способ поясняется следующим:

На фиг,2 - схема химических реакций

при иммобилизации олигонуклеотида в по- лиакриламидный гель-ПААГ; на фиг.З - кривые отмывки АТ-богатых (позиция а) и GC-богатых (позиция б) дуплексов (мисмат- чи выделены жирным шрифтом; М - матрица); на фиг.4 - зависимость отмывки дуплекса (показан вверху рисунка; М - матрица) от концентрации иммобилизованного олигонуклеотида. В пятне объемом 0,03 мм3 иммобилизовано 5 (1), 1,5(2), 0,5 (3) и 0,15 (4)

пмоль олигонуклеотида; на фиг.5 - уравни- ваниетемператур отмывки АТ-богатых и GC- богатых дуплексов путем подбора концентраций олигонуклеотидов, иммобилизованных в геле. (Структура дуплексов и

концентрации иммобилизованных олигонуклеотидов приведены на фиг,5 справа; М - матрица); на фиг.б - обнаружение мисмат- чей в дуплексах разного GC-состава на матрице с приведенными концентрациями

иммобилизованных олигонуклеотидов. Гибридизацию и отмывку проводили при 35°С. Остаточная радиоактивность приведена в процентах к уровню радиоактивности фрагмента ДНК, взятого для гибридизации; на

фиг.7 - гибридизация (позиция а) и отмывка (позиция б, в) флуоресцентно меченных фрагментов ДНК на гибридизационном чипе (1,4 - те же дуплексы, что и на фиг.З, позиция б). Размер квадратика 0,1 х 0,1 мм,

г-демонстрация чувствительности метода:

ячейки 1, 2.и 3 содержат соответственно 1

фмоль, 100 амоль и 10 амоль тетраметилродаминового производного дезоксиуридина.

П р и м е р 1. Возможность использования геля в качестве носителя в предлагае- .мом способе и устройстве подтверждается следующим примером.

Олигонуклеотиды были синтезированы твердофазным фосфорамидитным методом

(снятие защит проводили в насыщенном

водном растворе аммиака при 55°С в течение 12 ч) и очищены электрофорезом в ПА- АГ в денатурирующих условиях. Олигонуклеотиды метили Р(у PJATP и полинуклеотидкиназой Т4) по 5 -концу до специфической активности 3 мкКи/пмоль.

Из двух предметных стекол, одно из которых обработано Bind Silane, а другое - Repel Silane (LKB) и покрыто тонким слоем TritonX-ЮО, собирали сэндвич как для за- ливки плоских полиакрила мидных гелей с прокладкой толщиной 30 мкм. Сэндвич заполняли раствором 8%-го акриламида, 30:1 N,N -метиленбисакриламида, персульфата аммония и TEMED (как дл.я заливки ПААГ) и оставляли для полимеризации на 1 ч. После полимеризации верхнее стекло снимали. Стекло со слоем полиакриламида обрабатывали в течение часа при комнатной температуре 50%-ным гидразином. Для формирования матрицы часть геля удаляли. Олигодезоксинуклеотиды, содержащие на 3 -конце 3-метилилуридин, окисляли 1 мМ периодатом натрия в течение 1 ч при комнатной температуре, осаждали 10%-ю обь- емами 2%-го LJCI04 в ацетоне и растворяли в воде. На воздушно сухую матрицу для иммобилизации с помощью микроманипулятора, снабженного дозатором с капиллярной насадкой, наносили капли по 0,5 мкл окисленного олигонуклеотида (в концентрации 10 пмоль/мкл, если не оговорено особо), Пластинки помещали на А ч во влажную камеру, сушили 0,5 ч на открытом воздухе, промывали гибридизационным буфером (см. ниже), ополаскивали водой и хранили воздушно сухими при -20°С. Тонкие гели достаточно прочны и удобны в работе, позволяют благодаря прозрачности определять интенсивность флуоресценции при помощи микроскопа. Судя по изображениям то.зк иммобилизованных олигонуклео- тидов, гибридизованных с флуоресцентно мечеными фрагментами ДНК, олигонуклео- тиды иммобилизуются в виде компактного пятна площадью около 1 мм . Как правило, олигонуклеотиды иммобилизовали в ячейках квадратной матрицы, которая в дальнейшем называется олигонуклеотидно.й матрицей.

В качестве линкера выбран 3-мети- луридин, присоединенный 5 -З1 -меж- нуклертидной фосфодиэфирной связью к. иммобилизуемому олигонуклеотиду. Выбор 3-метилуридина определялся тем, что он не образует прочных водородных связей ни с одним из природных оснований.

Окисление 3 -концевого рибонуклео- зида олигонуклеотида 1 Nal04 приводит к производному 2 несущему на 3 -конце диальдегидную группировку. С другой стороны, при обработке полиакриламида 3 гидразином часть амидных.групп замещается нз гидразидные 4, которые легко реагируют с У -диальдегидом. При этом образуется относительно стабильное морфолиновое производное 5 (фиг.2).

Ход иммобилизации контролировали по 51 -32Р метке, введенной с помощью кина- зы в иммобилизуемые олигонуклеотиды. Выход иммобилизации, т.е. доля олигонуклеотида, необратимо связавшегося с гелем, 80%. При этом та же величина для неокисленного олигонуклеотида, использованного в качестве контроля на неспецифическую сорбцию, составила менее 2%. Таким образом, доля молекул, связанных специфически за 3 -конец, превышала 98%.

Связь олигонуклеотида с полиакрила- мидом устойчива, и матрица выдерживает не менее 5-7 циклов гибридизации/отмывки без заметного изменения гибридиэаци- онных свойств. Время полураспада связи олигонуклеотид-гель при 60°С составляет 2 ч, а при25°С-36ч,

Емкость носителя оценивали путем иммобилизации одного и того же количества 32Р-меченого олигонуклеотида, разбавленного немеченым до различной специфической активности. 100 пмоль холодного олигонуклеотида на точку (т.е. на 1 мм поверхности или 0,03 мм3 объема теля) не на- сыщали связывания. Аналогичные эксперименты с окисленным периодатом a показали, что емкость геля составляет около 1 нмоль на 1 мм поверхности геля. Это соответствует концентрации 30 мМ активных групп (концентрация амидных групп в 8%-ном полиакриламиде составляет 1 М).

П р и м е р 2, Гибридизация и дискриминация мисматчей в предлагаемом способе подтверждается следующим примером.

.На подготовленной, как в примере 1, олигонуклеотидной матрице была проведена гибридизация четырех гептадекануклео- тмдов - сиквенсового праймера фага М13:5 -d(GTAAAACACGCCAGT) и трех его производных, отличающихся одним основанием (подчеркнуто):

5 -d(GTAAAACGATGGCCAGT)

5 -d(CTAAAACGAAGGCCAGT)

5 -d(GTAAAACGACGGGCCAGT) с иммобилизованными в геле олигонуклео- тидами (длиной 7, 8, 9. 12 и 15 мономерных звеньев), полностью или частично комплементарными различным участкам гептаде- камеров.

Меченный фрагмент ДНК (0,1 мкКи, 30 фмоль). в 1 мкл буфера гибридизации (1 М

NaCI. 10 мМ фосфат, рН 7,0, 1 мМ EDTA) наносили на матрицу с иммобилизованными олигонуклеотидами так, что каждая капля гибрйдизационной смеси в точности покрывает точку иммобилизованного олиго- нуклеотида и инкубировали 1 ч при 0°С. Пластинку ополаскивали буфером гибридизации при 0°С, затем отмывали 10 раз по 1 мин 20 мл того же буфера при температуре, повышающейся на 5°С на каждой ступени отмывки, После каждой ступени гибридиза- ционный сигнал регистрировали через свинцовый коллиматор в каждой точке счётчиком радиоактивности (Minlmonitor 125, Victoreen, США), снабженным сумматором импульсов.

Отношение остаточной радиоактивности к исходной в данной точке откладывали на графике в логарифмическом масштабе в зависимости от температуры. Соответствующую сглаженную кривую мы будем называть в дальнейшем кривой отмывки дуплекса (фиг;3).

В качестве меры стабильности дуплексов выбрали температуру отмывки (Tw), которую определили как температуру, при которой гибридизационный сигнал в соответствующей точке уменьшается в 10 раз по отношению к исходному уровню. На фиг.З представлены кривые отмывки дуплексов, образованных праймером М13 или его аналогами с GC (фиг.З,а) и АТ-богатыми (фиг.З,б) октануклеотидами, иммобилизованными в геле, комплементарными двум различным участкам праймера М13, но образующими дефектные дуплексы с его производными (все дуплексы представлены на фиг.З). В дальнейшем 17-членные дезоксиолигонук- леотиды в отличие от иммобилизованных олигонуклеотидов мы будем называть фрагментами ДНК.

Кроме олигонуклеотидов, показанных на фиг.З, было исследовано значительное число 7-, 8-, 9-, 12- и 15-членников, полностью или частично комплементарных прай- меру М13, а также дуплексов, содержащих другие типы мисматчей. Данные по отмывке дуплексов гептадекадезоксинуклеотидов с иммобилизованными октадезоксинуклеоти- дами приведены в таблице.

Как видно из фиг.З и таблицы, почти всегда существует такая температура, при которой отношение гибридизационных сигналов полностью комплементарного и соот- ветствующего дефектного дуплекса достаточно велико (не менее 10 раз), чтобы надежно различить их. Исключение составляют некоторые красные мисматчи, стабильность которых аномально высока, Однако этот факт ни в коей мере не ограничивает применимость предлагаемого способа. Действительно, при исследовании известных последовательностей (например, выявление мутаций) всегда можно выбрать

такой иммобилизуемый олигонуклеотид, чтобы ожидаемая замена оснований оказалась внутри дуплекса. С другой стороны, при анализе неизвестной нуклеотидной последовательности (сиквенс ДНК) проблема

0 краевых мисматчей относительно легко решается при обработке на ЭВМ результатов гибридизации фрагмента ДНК с полной олигонуклеотидной матрицей. Способ обладает большей устойчивостью за счет избыт5 ка информации (в случае гибридизации с октануклеотидами мы получаем 7-кратный избыток информации, причем любой нукле- отид фрагмента ДНК в шести случаях из восьми образует внутреннюю пару с иммо0 билизованным олигонуклеотидом и лишь в двух случаях - краевую).

Таким образом, сравнение кривых отмывки позволяет различать полностью комплементарные и дефектные дуплексы и

5 таким образом обнаруживать одиночные замены оснований в ДНК.

Зависимость кривых отмывки дуплекса от объемной концентрации иммобилизованного олигонуклеотида в геле. Как видно из

0 фиг.4, Tw дуплекса сильно зависит от количества олигонуклеотида, иммобилизованного в пятне данного размера. Для исследованного интервала концентраций в

пределах экспериментальной ошибки тем5 пература отмывки дуплекса повышается на

определенное число градусов при увеличе нии концентрации иммобилизованного олигонуклеотида в определенное число раз. Данное правило выполняется для всех исс0 ледованных дуплексов (на фиг.4 приведен один из многочисленных примеров).

Это позволяет обнаруживать мисматчи в дуплексах разного GC-состава на одной пластинке. Как видно из фиг.З, показанные

5 там два иммобилизованных олигонуклеотида настолько различаются по GC-составу, что полностью комплементарный дуплекс АТ-богатого олигонуклеотида (фиг.З.а, кривая 1) менее устойчив, чем дуплексы GC-бо0 гатого, содержащие мисматчи (фиг.36, кривые 2 и 3). Очевидно, что в такой ситуации гибридизация фрагмента ДНК с матрицей, на-которой иммобилизованы оба олигонуклеотида, при любой фиксирован5 ной тег.-песатуре не позволяет узнать с точностью г.6 одного основания, имеются ли в данном фрагменте комплемента::мне им последовательности или нет.

Обнаруженная нами зависимость Tw от концентрации иммобилизованного слигонуклеотида позволяет решить проблему уравнивания температур диссоциации дуплексов различного GC-соста ва наиболее простым и изящным способом . Как показано на фиг.5, кривые отмывки AT- и GC-бога- того дуплексов (A Tw 30°C при равных концентрациях) могут быть полностью совмещены путем подбора концентраций иммобилизованных олигонуклеотидов в соответствующих точках.

Можно совместить кривые отмывки для любого набора олигонуклеотидов и таким образом получить приведенную матрицу олигонуклеотидов. Температуры отмывки полностью комплементарных (совершенных) дуплексов для всех точек такой матрицы близки между собой, что позволяет с помощью всего одной отмывки при оптимальной температуре однозначно определить те точки матрицы, с которыми анализируемый фрагмент ДНК образовал совершенные дуплексы.

Дополнительное достоинство приведенной матрицы заключается в том, что все ее точки можно не только отмывать, но и гибридизовать при той же оптимальной температуре, что существенно упрощает процедуру анализа. Гибридизация и отмывка при одной и той же оптимальной температуре увеличивает разрешение метода.

Указанный принцип проиллюстрирован в модельном эксперименте (фиг.6). Приведенную матрицу олигонуклеотидов (по три точки каждого из двух) гибридизовали и отмывали при 35°С. Соотношение остаточных сигналов однозначно показывает, в каких точках дуплексы были полностью комплементарными, несмотря на то, что один из мисматчей - краевой GT, весьма устойчив,

П р и м е р 3. Повышение чувствительности, точности и воспроизводимости предлагаемого способа и устройства подтверждается следующим примером.

Подготавливалась олигонуклеотидная матрица, как в примере 1,

Для гибридизации были использованы фрагменты с флуоресцентной меткой тетраметилродамином-ТМР на 3 -конце, вводимой с помощью терминальной пол,- инуклеотидтрансферазы. Сравнение соответствующих кривых отмывки показало, что ТМР не влияет на устойчивость дуплекса.

Использование флуоресцентной метки позволило проводить гибридизацию в микромасштабе. На фиг.7 представлены микрофотографии фрагмента микроматрицы, на которой октануклеотид 5 -d(GGCCGTCG) иммобилизован в квадратиках геля со стороной 100 мкм. Такие микроматрицы мы будем называть гибридизационными чипами. Как видно на фиг.7. позиция а, гибридизация с таким чипом позволяет весьма надежно детектировать замены отдельных оснований в последовательности (на фиг.7в 5 квадратик 1 правильный дуплекс квадратики 2, 3 и 4 дуплексы с мисматчами GA, GT и СС, соответственно).

Поскольку распределение флуоресцентной метки может быть измерено с очень

0 высокой чувствительностью и пространственным разрешением, например, при помощи микроскопа, то предел обнаружения гибридизационного сигнала определяется только отношением сигнал/фон и не зави5 сит от размеров объекта, интенсивность флуоресценции которого измеряется. Следовательно, чувствительность обратно пропорциональна площади объекта, т.е. ячейки олигонуклеотидной матрицы в нашем слу0 чае. Действительно, миниатюризация матрицы позволила очень сильно повысить чувствительность способа. Так, квадратики, изображенные на фиг.7, позиция г, содержат соответственно Т фмоль, 100 амоль и 10

5 амоль тетраметилродаминового производного дезоксиуридина. При этом отношение сигнал/фон для квадратика гЗ равно 2, что достаточно для надежного определения количества вещества.

0 Результаты модельных экспериментов, показывают принципиальную возможность анализа последовательности ДНК путем гибридизации со стандартным набором олигонуклеотидных проб, иммобилизован5 ных на одной пластинке (матрице). Метод позволяет однозначно отличать правильные дуплексы от содержащих одну неправильную пару. Использование приведенных матриц делает практическую процедуру

0 простой и удобной. Применение, флуоресцентной метки существенно упрощает процесс считывания информации. Наконец миниатюризация олигонуклеотидной матрицы, а в настоящее время получены чипы

5 с размером квадратиков геля 25 х 25 мкм, позволит не только экономить олигонуклео- тидный материал, что само по себе очень важно, но и автоматизировать как процедуру гибридизации и отмыв.ки, так и считыва0 ние и анализ информации.

Известно, что в мировой практике сто. имость определения 1-ой пары нуклеотидов составляет 3-5 долларов. Основные

преимущества предлагаемого способа

5 (при соответствующей доработке известного аппаратурного обеспечения) по сравнению с мировыми аналогами заключается в более высокой производительности при более низкой стоимости .за счет использования микроколичеств реагентов, а так же

вследствие снижения трудоемкости за счет возможности автоматизации всех процессов.

На известных мировых аналогах (к примеру, на модели секвинатора ТЕ2000 фирмы Hoefer Scientific Instruments США) цикл определения последовательности ДНК длиной 500 пар нуклеотидов составляет 22 ч. Из них 6 ч затрачивается непосредственно на секвенирование и 16 ч на радиоавтографию и расшифровку. Количества используемых реагентов измеряются в граммах.

Другие известные аналоги обеспечивают примерно такую же производительность, Отличие состоит лишь в объеме сервиса, представляемого пользователю.

Предлагаемый способ и устройство могут обеспечить производительность в 400 раз большую при одновременном сокращении рутинного труда пользователя. При этом количества основных реагентов измеряется в микрограммах.

Важно отметить, что в предлагаемом способе в основном используется не радиоактивная, а флуоресцентная метка.

Использование: молекулярная биология, в частности определение последовательности нуклеотидов в ДНК методом гибридизации. Сущность изобретения: на стеклянной подложке формируют матрицу из геля-носителя, наносят набор нуклеотидов, проводят гибридизацию с меченной тестируемой ДНК, гибридизацию и отмывку проводят при одинаковой температуре и определяют одиночные замены оснований в тестируемой ДНК по анализу распределения метки. Устройство для осуществления способа представляет собой стеклянную подложку и матрицу, представляющую собой одинаковые участки геля толщиной 10-30 мкм с наибольшей длиной 25-100 мкм с расстоянием между участками, равным удвоенной наибольшей длине. 2 с.п. ф-лы, 7 ил. 1 табл. ел

Формула изобретения

1, Способ определения нуклеотидной последовательности ДНК, включающий нанесение на стеклянную подложку набора олигонуклеотидов, проведение гибридизации с меченной тестируемой ДНК, отмывку npj/i температуре плавления дуплексов, определение одиночных замен оснований в тестируемой ДНК по анализу распределения метки, отличающийся тем, что, с целью повышения достоверности способа, упрощения определения известных точечных мутаций в нуклеотидной последовательности, на стеклянной .подложке

предварительно формируют матрицу из ге- .ля-носителя, а гибридизацию и отмывку проводят при одинаковой температуре.

Тепловая диссоциация совершенных дуплексов и дуплексов, содержащих одиночные

мисматчи

Данные усреднены по трем измерениям.

Понижение температуры отмывки дефектного дуплекса по сравнению с совершенным. Примечание. Мисматчи выделены жирным шрифтом, М - матрица, символ d для удобства

опущен.

а а а п п. п п с ааапсапа а п о п п п п .а

DDDDDDDD

RtU

«it. 2

о: О (D

D

100

Температура отмыбки, С

rW

GGCCGTCG /: З -TGACCGGCAGCAAAATG

,-Af

GGCCGTCG 2: 3 -TGACCGGTAGCAAAATG

Фиг. 3

(-Л/

GTCGTTTT 3 -TOACCGGCAGCAAAA Т G

Фие.4

Фиг. 5

GTCGTTTT M З -TGACCGGCAGCAAAATG

GTCGTTTT W

З1-TGACCGG A AGCAAAATG

GTCGTTTT W З -ТСАСССОтАОСААААТО

IGGCCGTCG- J3 -TGACCGGAAGCAAAATG

GGCCGTCG- 3 -TGACCGGTAGCA A AATG

020 40 60 80 ОстаЬшиеся буплексы, %

GGCCGTCG- З -TGACCGGCAGCAAAATG

100

Фиг. 6

/

J

Фиг.7