СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА "ИН ВИТРО" Российский патент 1995 года по МПК A01G17/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к способам размножения растений, и может быть использовано в виноградарстве для ускоренного размножения и оздоровления перспективных сортов винограда, в исследованиях по физиологии винограда, служит охране окружающей среды.

Известна основная модель клонального микроразмножения растений пролиферация пазушных побегов, основанная на снятии апикального доминирования [1] Есть два направления осуществления этого способа:
получение побегов нормальных пропорций с последующим их делением на однопочковые микрочеренки, которые используются в качестве вторичных эксплантов для повторения цикла размножения,
введение в питательную среду цитокининов, что приводит к формированию побегов с относительно укороченными междоузлиями, а пазушные почки и меристематические бугорки дают начало новым побегам.

Недостатком данного способа является недостаточно высокий коэффициент размножения в процессе культивирования.

Известен способ клонального микроразмножения винограда микрочеренкованием [2] при котором побег, образовавшийся из изолированной почки и имеющей 8-10 междоузлий, асептически разрезают на фрагменты, включающие узел с листом и почкой. Полученные микрочеренки высаживают в биологические пробирки на агаровую среду, так чтобы нижняя часть была погружена в агар, а затем культивируют в камере фитотрона.

Недостатком способа является то, что в качестве индуктора корнеобразования взята феруловая кислота, которая способна ингибировать рост побегов и снижать выход растений из черенков.

Известен способ микроклонального размножения винограда "Ин витро", включающий микрочеренкование пробирочных растений с 8-10 междoузлиями на фрагменты длиной 10-12 мм с узлом и листом и высадку их на твердую питательную среду Мурасиге Скуга [3]
В качестве индукторов корнеобразования здесь используют индолилмасляную и индолилуксусную кислоты.

Трудность заключается том, что при клональном микроразмножении растения растут относительно медленно и это ограничивает эффективность метода при размножении побегов микрочеренками. Одной из причин медленного роста являются стрессовые условия, в которых находятся растения "Ин витро". Кроме этого, основной сложностью технологии на первом этапе является ингибирование ростовых процессов экспланта токсическими веществами, выделямыми им в среду. В результате травмы, полученной эксплантом при изолировании, активизируются ферменты, окисляющие фенолы растений, различные фенолозы. Продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток экспланта. Чтобы улучшить положение добавляют активированный уголь, который уменьшает число погибающих растений, или антиоксиданты.

Изобретение предназначено для повышения эффективности клонального микроразмножения.

В предложенном способе микроклонального размножения винограда "Ин витро", заключающем микрочеренкование пробирочных растений с 8-10-ю междоузлиями на фрагменты длиной 10-12 мм с узлом и листом и высадку их на твердую питательную среду Мурасиге Скуга, в питательную среду добавляют тонкоразмолотые семена винограда в концентрации 0,1-0,5% от объема среды.

Новым в предложенном способе является то, что оптимизацию клонального микроразмножения осуществляют за счет питательной среды, в составе которой предлагают стимуляторы роста естественного прохождения, а именно семена винограда, в виде тонкоразмолотого порошка.

Известно, что виноградные семена используют при производстве масла, кормовой муки, удобрений, естественного парника. В предложенном способе семена используются как стимуляторы роста ввиду того, что в них находятся вещества с ценными биологическим свойствами: абсцизовая и хлорогеновая кислоты, общий фенолы, рутин, свободные ауксины и цитокинины.

В состав семян винограда входят такие осмотически активные вещества как соли, сахара, органические кислоты. Также входит большое количество фитогормонов (ауксинов и цитокининов), которые обладают трофическим действием, т.е. способны тормозить деструктивные процессы, которые являются характерной чертой старения органов или целых организмов. Использование семян винограда в виде тонкоразмолотого порошка позволяет адсорбировать токсические вещества, выделяемые растениями при их микрочеренковании в питательную среду, и заменить таким образом активированный уголь. Т.е. налицо неоднозначность предлагаемого приема: адсорбирование токсических веществ, выделяемых пробирочными растениями в питательную среду при их микрочеренковании, и обогащение питательной среды цитокининами, ауксинами и другими фитогормонами, входящими в состав семян винограда. Адсорбирование токсических веществ осуществляют с целью уменьшения ингибирования наружного роста и увеличения регенеративной способности выделенных эксплантов.

Способ осуществляют следующим образом.

Отбирают клонально-размноженные из меристематических верхушек пробирочные растения винограда. Растения должны иметь 8-10 глазков, а затем приступают к приготовлению питательной среды Мурасиге Скуга по общепринятой методике.

Применяют следующий порядок приготовления питательной среды. В 1 л бидистиллированной воды растворяют макроэлементы, микроэлементы, витамины и другие составные части среды.

Навеску предварительно промытого и высушенного агара переносят в колбу, заливают половинным количеством (от объема среды) бидистиллированной воды 1 л и нагревают на плите до 80-100^оС. Семена винограда тщательно промывают, просушивают, перемалывают на лабораторной мельнице до малой фракции около 5 мин. Добавляют их в раствор макро- и микроэлементов, сахара, витаминов и других составных частей среды. Молотые семена добавляют в концентрации 0,25% После растворения и некоторого охлаждения агара к нему добавляют приготовленный раствор. Температура агара и добавленного раствора одинаковая и составляет 80^оС.

Среду фильтруют через два слоя марли и доводят до нужного объема бидистиллятом.

Готовую среду разливают по пробиркам, которые закрывают предварительно простерилизованными в автоклаве ватными пробками, штатив с пробирками закрывают целлофаном и обвязывают шпагатом, а затем среду автоклавируют в автоклаве ГК-1000.

Микрочеренкование осуществляют в операционной комнате в ламинарном боксе "Роботрон". Побеги, имеющие 8-10 глазков, при помощи пинцета извлекают из пробирки, помещают на стерильную чашку Петри, разрезают на микрочеренки, имеющие узел с листом и почкой. Длина микрочеренка 10-12 мм, 2 мм над почкой, остальные под почкой. Получение микрочеренки высаживают в пробирки с приготовленной твердой средой, так чтобы нижняя часть до почки была погружена в агар. Культивирование осуществляют в культуральной комнате при освещенности 2,0-3,0 тыс.люксов, фотопериоде 16 ч, температуре 25-27±2^оС, влажности воздуха 70-75%
Наблюдения за ростом растений осуществляют через 15 дней. Добавление размолотых семян винограда в первую очередь влияет на развитие корневой системы увеличивается число корней и уменьшается их длина, что объясняется наличием в составе семян свободных ауксинов. В конечном итоге количество корней возрастает в 1,8 раза, соответственно уменьшается их длина, но корни от этого не ухудшаются, они становятся более мощными и общая их масса возрастает в 4,1 раза (табл.1.).

Это оказывает положительное влияние на рост побегов, образование листьев и новых узлов, хотя на первом этапе отличалось угнетение этих процессов, но на втором месяце культивирования скорость роста пробирочных растений увеличивается за счет добавления в питательную среду размолотых семян винограда, что способствует мощному развитию корневой системы. Торможение же роста в течение первого месяца зависит от наличия в составе семян абсцизовой кислоты и фенолов, которые являются ингибиторами широкого спектра действия.

Положительное действие добавки в питательную среду размолотых семян винограда наблюдали при их концентрации 0,1% от объема среды, максимальный положительный эффект был получен при концентрации 0,25% При дальнейшем увеличении концентрации размолотых семян в среде (0,5%) положительное действие сохраняется, но отмечается тенденция к его снижению.

Развитие пробирочных растений в зависимости от количества молотых семян винограда, добавленных в питательную среду (через 63 дня после начала культивирования), представлено в табл.2.

Таким образом, добавление в питательную среду естественных стимуляторов роста из размолотых семян винограда способствует значительному улучшению корневой системы пробирочных растений после их микрочеренкования, что в свою очередь благоприятствует лучшему росту побегов в высоту, развитию большой листовой поверхности, увеличению общей массы побегов. В результате этого увеличивается число узлов (листьев, в пазухе которых находится почка), которые дают начало новым растениям "Ин витро" после их микрочеренкования, т. е. увеличивается потенциальное микрочеренкование и эффективность клонального микроразмножения.

В табл. 3 и 4 соответственно показаны признаки и состав питательной среды.

Предложенная совокупность признаков способствует повышению эффективности клонального микроразмножения на 27,0% и достаточна для достижения поставленной цели.

Добавление в питательную среду размолотых семян винограда оказывает, в первую очередь, положительное влияние на укоренение и развитие корневой системы пробирочных растений: уменьшается длина главного и придаточных корней, но возрастает их число, что способствует увеличению корневой системы.

Динамика развития пробирочных растений без добавления и при добавлении в питательнуюс. реду размолотых семян винограда 0,25 об. среды представлена в табл.5.

Использование: в сельском хозяйстве и может быть использовано в виноградарстве для ускоренного размещения и оздоровления сортов винограда. Сущность способа: вначале осуществляют микрочеренкование пробирочных растений с 8 10-ю междоузлиями на фрагменты длиной 10 - 12 мм с узлом и листом, а затем высаживают их на твердую питательную среду Мурасиге Скуга. В питательную среду добавляют тонкоразмолотые семена винограда в концентрации 0,1 0,5 от объема среды. 5 табл.

СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА "ИН ВИТРО", включающий микрочеренкование пробирочных растений с 8 10 междоузлиями на фрагменты длиной 10 12 мм с узлом и листом, посадку их на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга и культивирование из них растений, отличающийся тем, что в питательную среду добавляют тонкоразмолотые семена винограда в концентрации 0,1 0,5% от объема среды.