СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА IN VITRO Российский патент 1997 года по МПК A01H4/00 C12N5/00 

Предлагаемое изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к способам размножения растений. Изобретение может быть использовано в виноградарстве для ускоренного размножения и оздоровления перспективных сортов винограда, в исследованиях по физиологии винограда. Служит охране окружающей среды.

Известен способ выращивания микроводорослей (Тамбиев А.Х. Кирикова Н.Н. Лапшин О. М. Изменение фотосинтетической активности микроводорослей под влиянием электромагнитного излучения. Физиология растений, 1992, т.39, вып. 5, с.1004), в котором стимулирующий эффект облучения сопровождается изменением ростовых характеристик, жизнеспособности, увеличением окислительной активности культуральной среды, что свидетельствует о лучшем физиологическом состоянии облученных микроводорослей.

Недостатком данного способа является то, что он разработан для микроводорослей и его результаты нельзя перенести на высшее растения, и в том числе повысить эффективность клонального микроразмножения винограда.

Известен способ микроклонального размножения винограда "ин витро", включающий микрочеренкование пробирочных растений с 8 10 междоузлиями на фрагменты длиной 10 12 мм с узлом и листом и высадку их в пробирки на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга (Дорошенко Н.П. Клональное микроразмножение и оздоровление посадочного материала винограда для создания из него сортовых маточников интенсивного типа. М. УНТИПиР, 1992, с.11 13) - прототип.

Недостатком способа является то, что пробирочные растения растут относительно медленно, при многократных повторных субкультивированиях состояние их ухудшается, снижается выход микрочеренков, что ограничивает эффективность метода при размножении растений микрочеренкованием.

Предложенное изобретение предназначено для повышения эффективности клонального микроразмножения винограда.

В предложенном способе клонального микроразмножения винограда "ин витро", включающем микрочеренкование пробирочных растений с 8 10 междоузлиями на фрагменты длиной 10 12 мм с узлом и листом и высадку их в пробирки на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга, микрочеренки, высаженные в пробирки, подвергаются воздействию электромагнитного излучения с частотой 37,5 ГГц и напряженностью 20 мВт, при этом расстояние пробирок с микрочеренками от источника высокочастотных сигналов составляет 20 60 см с параллельным к источнику облучения расположением или перпендикулярным в один-два ряда расположением пробирок в ряду в количестве от 5 до 14.

Новым в предложенном способе является то, что оптимизацию клонального микроразмножения осуществляют за счет воздействия на микрочеренки электромагнитного излучения низкой интенсивности миллиметрового диапазона.

Существенным является то, что расстояние пробирок с микрочеренками от источника высокочастотных сигналов составляет 20 60 см с расположением пробирок параллельно к источнику сигналов в один ряд или перпендикулярно в один-два ряда с количеством пробирок от 5 до 14.

Биологическое воздействие электромагнитного излучения СВЧ-полей относится к новой отрасли биологии мембранологии, где особое внимание уделяется первичным молекулярным эффектам действия электромагнитных полей на данные структуры. СВЧ-поле, проникая в клетку, оказывает свое модифицирующее влияние на мембраны, преодолевает их и адаптирует, в первую очередь действуя на белки и липиды мембран. Электромагнитные поля СВЧ, добавляя квант энергии в систему мембран, производят их перестройку и прежде всего подвергают разрыву двойные связи в непредельных жирных кислотах липидов. Этот разрыв сопровождается образованием свободных радикалов в липидах, обладающих выраженными физиологическими акцентами. И в зависимости от уровня радикалов в биообъектах можно выделить стимулирующее и угнетающее воздействие и стационарную фазу. Стимуляция происходит в тот момент, когда достигается определенный уровень свободных радикалов (в основном начальных их форм). При этом изменяется проницаемость клеточных мембран, усиливается приток питательных веществ, воды и кислорода, активизируются ферментативные системы обмена веществ, роста и развития растения.

Таким образом, налицо неоднозначность предлагаемого приема: увеличение окислительной активности культуральной среды, повышение проницаемости клеточных мембран, активизация обменных процессов.

Положительное действие облучения наблюдается при различной плотности падающей мощности. Во всех вариантах способа происходит увеличение средней скорости роста, ростовых характеристик побегов, массы побегов и количества узлов, образовавшихся на них. Максимальный положительный эффект получают при расположении пробирок на расстоянии 20 см от источника облучения перпендикулярно к нему в два ряда по 5 пробирок в ряду. Так, скорость роста побегов увеличилась в 1,7 1,8 раза, длина корней в 1,2 1,5 раза, побегов в 1,4 1,7 раза, вес сырой массы в 1,9 2,0 раза, число образовавшихся узлов на побеге в 1,3 1,5 раза. Показатели развития пробирочных растений второго ряда несколько ниже, чем у растений первого ряда. Также самые хорошие результаты получают при расположении пробирок в один ряд параллельно СВЧ-лучам. В этом варианте число корней и их длины не изменяются и остаются на уровне контрольной. Скорость роста побегов увеличивается в 1,5 раза, длина их и масса в 1,6 раза, число образовавшихся узлов в 1,4 раза.

Достаточно высокие показатели развития отмечаются у растений второго ряда при размещении 7 пробирок на расстоянии 20 (40) см от источника облучения. Растения первого ряда этого варианта уступают им по своему развитию. Наиболее слабым развитием среди облученных растений отличаются растения варианта 20 (40) см 11+11. Растения, находящиеся во втором ряду, развиваются несколько лучше.

Таким образом, при различном расположении пробирок плотность падающей мощности СВЧ-лучей изменяется, что создает более или менее оптимальные условия для облученных растений. Стимулирующее влияние СВЧ-лучей в вариантах 20 см 5+5,20 (60) см 14; 20(40) см 7+7(2) объясняется тем, что при облучении достигается такой уровень свободных радикалов, который способствует повышению проницаемости клеточных мембран и усилению обменных процессов, что улучшает среднесуточную скорость роста и, как следствие, ростовые характеристики облученных растений.

Способ размножения винограда "ин витро" схематически изображен на фиг.1, где изображено:
а) расположение пробирочных растений винограда "ин витро" на расстоянии 20 см от генератора высокочастотных сигналов в 2 ряда по 5 пробирок в ряду;
б) расположение пробирочных растений винограда "ин витро" также на расстоянии 20 см от генератора высокочастотных сигналов в 2 ряда по 7 пробирок с расстоянием между рядами 20 см;
в) расположение пробирочных растений такое же, но в ряду помещается по 11 пробирок;
г) расположение 14 пробирочных растений в 20 см от генератора высокочастотных сигналов вдоль лучей СВЧ на расстоянии 40 см.

Способ осуществляют следующим образом.

Отбирают клонально размноженные из меритстематических верхушек пробирочные растения винограда. Растения должны иметь 8 10 глазков, а затем приступают к приготовлению твердой питательной среды Мурасиге-Скуга.

Микрочеренкование осуществляют в операционной комнате в ламинарном боксе "Роботрон". Побеги, имеющие 8 10 глазков, при помощи пинцета извлекают из пробирки, помещают на стерильную чашку Петри, разрезают на микрочеренки, имеющие узел с листочком и почкой. Длина микрочеренка 10 12 мм, 2 мм над почкой, остальные под почкой. Полученные микрочеренки высаживают в пробирки с приготовленной средой, так чтобы нижняя часть до почки была погружена в агар.

Пробирки закрывают пробками и приступают к электромагнитному облучению. Для облучения используют генератор высокочастотных сигналов с диапазоном частот 37,5 53,57 ГГц. Мощность СВЧ- сигнала 20 мВт. Точность определения длины волны не менее 0,01 мм. Продолжительность одноразового облучения составляет 60 мин. Плотность падающей мощности регулируют расстоянием и способом расположения пробирок по отношению к источнику облучения. Расстояние от источника высокочастотных сигналов 20 см. Пробирки располагают перпендикулярно к источнику облучения в два ряда по 5 пробирок в ряду 20 см 5+5( фиг. 1а); по 7 пробирок в ряду, расстояние между рядами 20 20(40) см 7+7( фиг. 1б); по 11 пробирок в ряду 20(40) см 11+11( фиг.1в); вдоль направления лучей в один ряд протяженностью 40 20(60) см 14 пробирок в ряду( фиг.1г).

После облучения культивирование осуществляют в культуральной комнате при освещенности 2,0 3,0 тыс. люкcов, фотопериоде 16 час, температуре 25 - 27^oС, влажности воздуха 70 75%
В табл.1 показано развитие пробирочных растений в зависимости от размещения пробирок по отношению к источнику облучения (через 70 дней культивирования).

СВЧ-лучи оказывают влияние на образование и рост корней у пробирочных растений: увеличивается число корней, средняя длина одного корня, общая длина корней у растения. В табл.2 показано влияние СВЧ-лучей на развитие корневой системы пробирочных растений (70-й день культивирования).

Более значительное влияние СВЧ-лучи оказывают на среднесуточную скорость роста пробирочных растений при различной плотности падающей мощности. При оптимальных параметрах электромагнитного излучения среднесуточная скорость роста побегов резко возрастает на 30-й день, достигает своего максимума на 50-й день и незначительно снижается на 70-й день культивирования. В табл.3 представлена среднесуточная скорость роста побегов пробирочных растений винограда при различной плотности падающей мощности СВЧ-лучей.

Увеличение скорости роста, в свою очередь, способствует увеличению длины побегов, увеличению числа узлов и увеличению массы побегов (табл.4). То есть увеличивается потенциальное микроразмножение и улучшается качество микрочеренков, из которых будут формироваться в дальнейшем новые растения.

В табл. 5 показана динамика развития пробирочных растений винограда без облучения и после облучения при оптимальной плотности падающей мощности.

Наблюдение за динамикой роста и развития винограда "ин витро" (табл.5) показало, что под воздействием электромагнитного излучения происходит изменение ростовых характеристик во время всего периода культивирования. Установлено у облученных растений увеличение суточной скорости роста и длины побега на 30-й день культивирования в 2,3 2,4 раза, но 50-й день в 1,7 1,8 раза, на 70-й день в 1,7 раза. Число образовавшихся узлов на побеге увеличилось соответственно в 1,3; 1,2 и 1,5 раза. Также установлено, что у облученных растений эти показатели на 50-й день культивирования выше, чем у необлученных на 70-й день клуьтивирования. То есть возможно сократить период культивирования до 50 60-ти дней, чаще проводить субкультивирование и тем самым повысить эффективность клонального микроразмножения винограда при высоком качестве микрочеренков.

Использование: изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к способам размножения и оздоровления перспективных сортов винограда. Сущность изобретения: способ заключается в том, что он включает микрочеренкование пробирочных растений с узлом и листом и высадку их в пробирки на питательную среду Мурасиге-Скуга, при этом черенки подвергают воздействию электромагнитного излучения и располагают от источника излучения на расстоянии 20 - 60 см параллельно к нему или перпендикулярно в один-два ряда с количеством пробирок в ряду от 5 до 14. 5 табл., 1 ил.

1 Способ размножения винограда in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений с 8 10-тью междоузлиями на фрагменты длиной 10 12 мм с узлом и листом и высадку их в пробирки на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга, отличающийся тем, что микрочеренки, высаженные в пробирки, подвергают воздействию электромагнитного излучения с частотой 37,5 ГГЦ и напряженностью 20 мВт, при этом устанавливают пробирки на расстоянии 20 60 см от источника высокочастотных сигналов параллельно или перпендикулярно к источнику облучения в один-два ряда по 5 14 пробирок в ряду.