СОСТАВ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ БАКТЕРИЙ Российский патент 1995 года по МПК C12N1/04 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к хранению микроорганизмов, и может быть использовано в научной и практической медицине, в биотехнологии и пищевой промышленности для хранения штаммов продуцентов различных веществ.

Известны составы сред, применяемые при консервировании микроорганизмов. Среда "Mist. dissicans" [1] содержащая 7,5% глюкозы, 3 ч. нормальной лошадиной сыворотки и 1 ч. бульона.

Недостатком данной среды следует признать отсутствие стандартности ее приготовления в силу присутствия в ней лошадиной сыворотки и бульона, приготовленного из сырья различного качества.

Сахарозо-желатиновая среда (Данилова М.В. Надирова И.М. Кудрявцев В.И. Лиофилизация бактерий. В кн. Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов. М. Наука, 1967, с.131), содержащая 10% сахарозы и 0,1% агара в 1,5% желатине.

Недостатком данной среды является невозможность хранения различных бактериальных штаммов в течение длительного времени.

Известен также способ консервирования клеток Fusarium moniliforme Pg-7 [2] содержащий в качестве криопротектора 1-3%-ный раствор сахарозы или 1-5% -ный раствор диметилсульфоксида, или 1-3%-ный раствор глицерина.

Недостатком данного способа является узкий спектр применения один вид клеток Fusarium moniliforme Pg-7, хранящийся в условиях замораживания при низкой температуре.

Наиболее близким к предлагаемому является состав защитной среды М.М. Файбича [3] используемый для лиофильного высушивания культур чумного микроба, псевдотуберкулеза и других микробов. Среда содержит 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара.

Недостатком данной среды является весьма короткий промежуток времени хранения культур, что заставляет повторять процесс лиофилизации, проводить посевы, ведущие к утрате отдельных свойств штамма.

Целью изобретения является увеличение продолжительности хранения культур.

Сущность изобретения в том, что в состав для хранения бактерий, содержащий водный раствор защитной белковой среды и криопротектор, введен раствор трикетона 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександиона-1,3 при следующем соотношении компонентов, мас. Защитная белковая среда 0,05-30 Трикетон (А) 0,001-0,025 Растворитель трике- тона (А) 0,1-10 Вода Остальное В качестве растворителя трикетона (А) может быть использован диметилсульфоксид или спирт, или диоксан. Состав для хранения бактерий может иметь следующее соотношение компонентов, мас. сахароза 1-12; желатина 0,7-5; агар-агар 0,02-0,1; трикетон (А) 0,001-0,025; растворитель трикетона (А) 0,1-10; вода остальное.

В научной, патентной, технической и другой литературе отсутствуют данные о подобных составах для хранения бактерий.

Неизвестны факты пригодности трикетона 5,5-диметил-2 (1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександиона-1,3 (А) как компонента криопротекторной среды. Это не только неочевидное, более того неожиданное свойство данного соединения. Увеличение срока хранения бактерий до 7-16 лет обусловило положительный эффект изобретения.

Таким образом, данное решение соответствует критериям изобретения.

Заявляемый состав для хранения бактерий приготавливают следующим образом (расчет на 1 л воды). 0,2-1 г агара-агара замачивают в 0,7 л дистиллированной воды, ставят на огонь, при постоянном помешивании добавляют предварительно замоченный расбухший желатин (7-50 г). После растворения желатина добавляют сахарозу (10-20 г), доводят до кипения. Снимают с огня и доводят объем до 1 л дистиллированной водой, фильтруют, разливают в посуду и стерилизуют при 110^оС 30 мин. Затем в полученную смесь вводят трикетон (А), растворенный в одном из указанных растворителей (диметилсульфооксиде, диоксане, спиртах).

Трикетон 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександион-1,3 (А). Соединение получено компенсацией по Михаэлю циклического β-дикетона-5,5-диметилциклогександиона-1,3 (димедон) с халконом-бензальацетофеноном в условиях основного катализа. В качестве катализатора используют пиперидин либо эпилат натрия. Выход продукта составляет от 50 до 87% Состав и строение полученного трикетона (А) было подтверждено данными элементного анализа и ИК-спектроскопии. Образец соединения, используемого в данных исследованиях, был идентифицирован по температуре плавления пробы, смешивания с образцом, полученным ранее (Лелюх Л.И. Коршунова К.М. Харченко В.Г. Синтез трикетонов 1,3-диарил-3-(2-дигидрорезорцинил)-1-пропанонов. Химия и химическая технология. 1975, Т.XVIII. Вып.10, с.1537-1539; Каразинова Т.Д. Маркова Л.И. Харченко В. Г. 5-оксогексагидрохинолины конденсированные аналоги 1,4-дигидропиридинов. Получение и свойства. Химия гетероциклических соединений. 1990, N 4, с.511-514).

П р и м е р 1. Вакцинный штамм чумного микроба ЕУ выращивали в оптимальном температурном режиме на скошенном агаре Хоттингера до стационарной фазы роста и суспендировали в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агара-агара с добавлением 0,01% 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогексан- диона-1,3, растворенного в 0,1% диметилсульфооксиде (ДМСО). Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали. В результате проведенных экспериментов установлено, что 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександион-1,3 в концентрациях 0,001-0,025% увеличивает продолжительность хранения живой чумной вакцины ЕУ в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 2,3 г (в контроле) до 2,9-7,7 лет в зависимости от концентрации трикетона (А), т.е. в 1,2-3,4 раза.

П р и м е р 2. В составе, описанном в примере 1, хранили псевдотуберкулезный микроб. Срок хранения увеличивался с 4,4 до 7,6-16,3 лет (в 1,7-3,7 раза).

П р и м е р 3. Возбудитель кишечного иерсиниоза хранили в составе, Сахароза 15 Желатина 1 Агар-агар 0,02 Трикетон (А) 0,01 Растворитель-диоксан 0,25 Вода Остальное При соблюдении технологии хранения, описанной в примере 1, срок хранения увеличивается до 2,8 лет, что превышает контрольный срок в 1,2 раза.

В таблице показано влияние трикетона (А), приготовленного в различных растворителях, на продолжительность хранения вакцинного штамма чумного микроба ЕУ в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток.

Вывод: из приведенной таблицы следует, что оптимальный результат получается при растворении трикетона (А) в 1-10% ДМСО с концентрацией трикетона 0,0010% (срок хранения увеличивается в 3,6 раза).

П р и м е р 3. Изучение влияния защитной среды с 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександионом-1,3 на продолжительность хранения микроорганизмов вида Vibrio cholerae в лиофилизированном состоянии проведено на четырех штаммах биоваров cholerae и eltor и сероваров Ogawa и Inaba.

Штаммы выращивали на скошенном агаре Хоттингера рН 7,6 в оптимальном температурном режиме до стационарной фазы роста и суспензировали в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара с добавлением 0,0002-0,0025% 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)- циклогександиона-1,3, растворенного в 0,1%диметилсульфоксиде (ДМСО). Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали. В результате проведенных экспериментов установлено, что 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогек- сандион-1,3 в указанных выше концентрациях увеличивает продолжительность хранения штаммов холерного вибриона в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 2,5 лет (в контроле) до 2,8-4,8 года в зависимости от концентрации, т.е. в 1,1-1,9 раза.

П р и м е р 4. Изучение влияния защитной среды с 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександионом-1,3 на продолжительность хранения микроорганизмов Bacillus anthracis в лиофилизированном состоянии проведено на одном штамме возбудителя сибирской язвы.

Штамм выращивали на агаре Хоттингера рН 7,2 при температуре 37^оС до стационарной фазы роста (18-24 ч). Суспензию готовили в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины, 0,1% агар-агара с добавлением 0,0005-0,01% 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександ- иона-1,3, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО). Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали.

В результате проведенных экспериментов установлено, что 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександион-1,3 в концентрации 0,0005% увеличивает продолжительность хранения штамма возбудителя сибирской язвы в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 5,9 лет (в контроле) до 16,1 года, т.е. в 2,7 раза.

П р и м е р 5. Изучение влияния защитной среды с 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександионом-1,3 на продолжительность хранения микроорганизмов Francisella tularensis в лиофилизированном состоянии проведено на 1-м штамме туляремийного микроба.

Штамм выращивали на рыбно-дрожжевом агаре, рН 7,0 при температуре 37^оС до стационарной фазы роста (42-48 ч). Суспензию микроорганизмов готовили в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара с добавлением 0,0005-0,0100% 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександио- на-1,3, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО). Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали.

В результате проведенных экспериментов установлено, что 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександион-1,3 в указанных концентрациях увеличивает продолжительность хранения штаммов возбудителя туляремии в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 1,9 года (в контроле) до 2,9-6,6 лет в зависимости от концентрации, т.е. в 1,5-3,4 раза.

П р и м е р 6. Изучение влияния защитной среды с 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександионом-1,3 на продолжительность хранения микроорганизмов Brucella melitensis в лиофилизированном состоянии проведено на 1-м штамме.

Штамм бруцелл выращивали на эритрит-агаре, рН 7,0 при температуре 37^оС до стационарной фазы роста (42-48 ч). Суспензию микроорганизмов готовили в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара с добавлением 0,0005-0,0100% 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександиона-1,3, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО). Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали.

В результате проведенных экспериментов установлено, что 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександион-1,3 в концентрации 0,0005% увеличивает продолжительность хранения штамма возбудителя бруцеллеза в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 3,8 лет (в контроле) до 10,2 лет, т.е. в 2,6 раза.

П р и м е р 7. Изучение влияния защитной среды с 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександионом-1,3 с применением в качестве растворителя метанола проводили на модели представителя семейства Enterobacteriaceae вакцинном штамме чумного микроба ЕУ.

Штамм выращивали на скошенном агаре Хоттингера рН 7,2 в оптимальном температурном режиме до стационарной фазы роста и суспензировали в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара с добавлением 0,005% 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогек- сандиона-1,3, растворенного в 0,1% метаноле. Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали.

В результате проведенных экспериментов установлено, что 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександион-1,3 в указанной выше концентрации увеличивает продолжительность хранения вакцинного штамма чумного микроба ЕУ в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 1,7 года (в контроле) до 2,0 лет, т.е. в 1,2 раза.

П р и м е р 8. Изучение влияния защитной среды с 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександионом-1,3 с применением в качестве основного компонента защитной белковой среды нормальной лошадиной сыворотки проводили на представителе семейства Enterobacteriaceae штамме Y. pestis ЕУ.

Штамм выращивали на скошенном агаре Хоттингера рН 7,2 в оптимальном температурном режиме до стационарной фазы роста и суспензировали в среде, состоящей из нормальной лошадиной сыворотки и бульона Хоттингера рН 7,2 (3: 1) в соотношении 1,7-18 мас. к общему составу с добавлением 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександиона-1,3, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО).

В результате проведенных экспериментов установлено, что защитная белковая среда с применением лошадиной сыворотки и бульона Хоттингера с добавлением 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-цик- логександиона-1,3 в указанной выше концентрации увеличивает продолжительность хранения вакцинного штамма чумного микроба ЕУ в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% выживших клеток с 4,1 года (в контроле) до 6,5 лет, т.е. в 1,6 раза.

Использование: микробиология. Сущность изобретения: состав для хранения бактерий содержит водный раствор защитной белковой среды, раствор трикетона
5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександиона-1,3 и растворитель при следующем соотношении компонентов, мас. защитная белковая среда 0,05 30; трикетон 0,001 0,025; растворитель 0,1 - 10; вода остальное. В качестве растворителя трикетона может быть использован диметилсульфоксид или спирт, или диоксан. Состав увеличает продолжительность хранения культур. 4 з. п. ф-лы, 1 табл.

1. СОСТАВ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ БАКТЕРИЙ, включающий защитную белковую среду и воду, отличающийся тем, что он дополнительно содержит 5,5-диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександион-1,3 и его растворитель при следующем соотношении компонентов, мас.

Защитная белковая среда 0,05 30,0
5,5-Диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександион-1,3 0,001 - 0,025
Растворитель 0,1 10
Вода Остальное
2. Состав по п.1, отличающийся тем, что в качестве растворителя он содержит диметилсульфоксид.

Сахароза 1 12
Желатина 0,7 5,0
Агар-агар 0,02 0,10
5,5-Диметил-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександион-1,3 0,001 - 0,025
Растворитель 0,1 10,0
Вода Остальное