СОСТАВ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ БАКТЕРИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/04 A61K39/02 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к области хранения микроорганизмов и может быть использовано в научной и практической медицине, в биотехнологии для хранения штаммов-продуцентов различных веществ.

Известны составы сред, применяемые при консервировании микроорганизмов. Среда "Mist dissicans" (Данилова М.В. Надирова И.М. Кудрявцев В.И. Лиофилизация бактерий. В кн. "Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов". -М. Наука.-1967. с.119-135), содержащая 7,5% глюкозы, 3 части нормальной лошадиной сыворотки и 1 часть бульона.

Недостатком данной среды следует признать отсутствие стандартности ее приготовления в силу присутствия в ней лошадиной сыворотки и бульона, приготовленного из сырья различного качества.

Известна также сахарозо-желатиновая среда /Данилова М.В. Надирова И.М. Кудрявцев В. И. Лиофилизация бактерий. В кн. "Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов". М. Наука.-1967.-с.131/, содержащая 10% сахарозы и 0,1% агара в 1,5% желатине.

Недостатком данной среды является невозможность хранения различных бактериальных штаммов в течение длительного времени.

Известен также состав консервирования клеток Fusarium moniliforme Pg-7 /А. с. N 1110799, МКИ: С 12N1/00/, содержащий в качестве криопротектора 1-3% раствор сахарозы, или 1-5% раствор диметилсульфоксида, или 1-3% раствор глицерина.

Недостатком данного состава является узкий спектр применения: один вид клеток Fusarium monoliforme Pg-9, хранящийся в условиях замораживания при низкой температуре.

Наиболее близким к предлагаемому является состав защитной среды М.М.Файбича (Файбич М. М. Об эффективности противочумной сухой вакцины. -ЖМЭИ. -1946. -Т.6 -С.32), используемый для лиофильного высушивания культур чумного микроба, псевдотуберкулеза и других микробов. Среда содержит 10% сахарозы, 1,5% желатина и 0,1% агар-агар.

Недостатком данной среды является весьма короткий промежуток хранения культур, что заставляет повторять процесс лиофилизации, проводить посевы, ведущие к утрате отдельных свойств штамма.

Целью настоящего изобретения является увеличение продолжительности хранения культур.

Сущность изобретения заключается в том, что в состав для хранений бактерий, включающий защитную белковую среду и воду, введен 7,7-Диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидрохинолин, и его растворитель при следующем соотношении компонентов, мас.

защитная белковая среда 1,8-24
7,7-Диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидрохинолин 0,001-0,05
растворитель 0,1-5,0
вода 0,1-5,0
Защитная белковая среда может иметь состав мас. сахароза 1-20, желатина 0,8-3,5, агар-агар 0,05-0,1. В качестве растворителя может быть использован диметилсульфоксид и этанол. В научной, технической, патентной и другой литературе отсутствуют данные о подобных составах для хранения бактерий.

Неизвестны факты пригодности 7,7-Диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5, 6, 7, 8-тетрагидрохинолина как компонента криопротекторной среды. Это не только неочевидное, более того неожиданное свойство данного соединения. Увеличение срока хранения бактерий до 15-42 лет обусловило положительный эффект изобретения.

Таким образом, данное решение соответствует критериям изобретения.

Заявляемый состав для хранения бактерий приготавливают следующим образом /расчет воды на 1 л воды/. 0,2-1 г агар-агара замачивают в 0,7 л дистиллированной воды, ставят на огонь, при постоянном помешивании добавляют предварительно замоченный разбухший желатин /7-50г/. После растворения желатина добавляют сахарозу /10-120г/, доводят до кипения. Снимают с огня и доводят объем до 1 л дистиллированной водой, фильтруют, разливают в посуду и стерилизуют при 110^oC 30 мин. Затем в полученную смесь вводят 7,7-Диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидрохинолин, выполняющего роль криопротектора, растворенный в диметилсульфоксиде или этаноле.

7,7-Диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидрохинолин получен методом гетероциклизации оксо-1,5-дикетоно-5,5-диметил-2-/1,3-дифенил-3-оксопропил/- иклогексан-1,3-диона с ацетатом аммония/ выход продукта составляет 58%/ [В. Г. Харченко, Л. И. Маркова, Т.Д.Казаринова, Л.М.Юдович. О характере гетероциклизации трикетонов ряда 2-/3-оксопропил/-циклогексан-1,3-дионов//Химия гетероциклических соединений.-1985.-N 7.-С.915-918]
Состав и строение полученного тетрагидрохинолина было подтверждено данными элементного анализа и ИК-спектроскопии. Образец соединения, используемого в данных исследованиях, был идентифицирован по температуре плавления пробы смешивания с образцом, полученным ранее.

Криопротективную активность вещества предварительно оценивали приборным методом на хемилюминометре LKB-Wallac 1251, основанном на оценке активности перекисных радикалов в системе свободно-радикального окисления, инициированного перекисью водорода. Тестируемое вещество показало высокую активность.

Примеры конкретного выполнения
N 1. Вакцинный штамм чумного микроба EV представитель широко распространенного в природе семейства Enterobacteriaceae выращивали в оптимальном температурном режиме на скошенном агаре Хоттингера до стационарной фазы роста и суспендировали в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатина и 0,1% агар-агара с добавлением 0,001-0,05% 7,7 -Диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидрохинолина, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде /ДМСО/ или 96% этаноле. Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали. В результате проведенных экспериментов установлено, что 7,7-Диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5, 6, 7, 8-тетрагидрохинолин в указанных выше концентрациях увеличивает продолжительность хранения живой чумной вакцины EV в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 6 лет /в контроле/ до 8-15 лет в зависимости от концентрации, то есть в 1,4-2,5 раза.

N 2. Вакцинный штамм Br.abortus 19А представитель семейства Brucellaceae с неясным систематическим положением выращивали в оптимальном температурном режиме на скошенном питательном агаре, приготовленном из сухого концентрата /г. Оболенск Московская область/ до стационарной фазы роста и суспендировали в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатина и 0,1% агар-агара с добавлением 0,001-0,05% 7,7-Диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидрохинолина, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде /ДМСО/ или 96% этаноле. Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали. В результате проведенных экспериментов установлено, что 7,7-Диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидрохинолин в указанных выше концентрациях увеличивает продолжительность хранения вакцинного штамма Br.abortus 19А в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 13,2 года /в контроле/ до 17,9-20 лет в зависимости от концентрации, то есть в 1,36-1,52 раза.

Использование: биотехнология, микробиология, лиофилизация, защитная среда, хранение микроорганизмов. Сущность изобретения: состав для хранения бактерий, содержит защитную белковую среду, 7,7-Диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидрохинолин, его растворитель и воду при определенном соотношении компонентов. Защитная белковая среда может иметь состав, мас.%: сахароза - 1 - 20, желатина - 0,8 - 3,5, агар-агар - 0,05 - 0,1. В качестве растворителя может быть использован диметилсульфоксид и этанол. 3 з.п. ф-лык

1. Состав для хранения бактерий, включающий защитную белковую среду и воду, отличающийся тем, что он дополнительно содержит 7,7-диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидрохинолин и его растворитель при следующем соотношении компонентов, мас.

Защитная белковая среда 1,8 24,0
7,7-Диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидрохинолин 0,001 0,05
Растворитель 0,1 5,0
Вода Остальное
2. Состав по п.1, отличающийся тем, что защитная белковая среда имеет состав, мас.

Сахароза 1 20
Желатин 0,8 3,5
Агар-агар 0,05 0,1
3. Состав по п.1, отличающийся тем, что в качестве растворителя 7,7-диметил-2,4-дифенил-5-оксо-5,6,7,8-тетрагидрохинолина содержит диметилсульфоксид.