СОСТАВ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ БАКТЕРИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/04 A61K39/02 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к области хранения микроорганизмов, и может быть использовано в научной и практической медицине, в биотехнологии для хранения штаммов-продуцентов различных веществ.

Известны составы сред, применяемые при консервировании микроорганизмов. Среда "Mist dissicans" (Данилова М.В. Надирова И.М. Кудрявцев В. И. Лиофилизация бактерий. Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов. М. Наука, 1967. с.119-135), содержащая 7,5% глюкозы, 3 части нормальной лошадиной сыворотки и 1 часть бульона.

Недостатком данной среды следует признать отсутствие стандартности ее приготовления в силу присутствия в ней лошадиной сыворотки и бульона, приготовленного из сырья различного качества.

Известна также сахарозо-желатиновая среда (Данилова М.В. Надирова И.М. Кудрявцев В.И. Лиофилизация бактерий. Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов. М. Наука, 1967, с. 131), содержащая 10% сахарозы и 0,1% агара в 1,5% желатине.

Недостатком данной среды является невозможность хранения различных бактериальных штаммов в течение длительного времени.

Известен также состав консервирования клеток Fusarium moniliforme Pg-7 (авт. cв. N 1110799, кл. С 12 N 1/00), содержащий в качестве криопротектора 1-3% раствор сахарозы, или 1-5% раствор диметилсульфоксида, или 1-3% раствор глицерина.

Недостатком данного состава является узкий спектр применения: один вид клеток Fusarium monoliform Pg-9, хранящийся в условиях замораживания при низкой температуре.

Наиболее близким к предлагаемому является состав защитной среды М.М.Файбича (Файбич М.М. Об эффективности противочумной сухой вакцины. ЖМЭИ, 1946, т. 6 с. 32), используемый для лиофильного высушивания культур чумного микроба, пcевдотуберкулеза и других микробов. Среда содержит 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара.

Недостатком данной среды является весьма короткий промежуток хранения культур, что заставляет повторять процесс лиофилизации, проводить посевы, ведущие к утрате отдельных свойств штамма.

Цель изобретения является увеличение продолжительности хранения культур.

Сущность изобретения заключается в том, что в состав для хранения бактерий, включающих защитную белковую среду и воду введен 7,7-диметил-2-фенил-4-/4¹-метоксифенил/-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин, и его растворитель при следующем соотношении компонентов, мас.

Защитная белковая среда 1,5-20
7,7-диметил-2-фенил-4-/4¹-метоксифенил/-5-оксо-1,4,5,6,7, 8-гексагидрохинолин 0,001-0,1
Растворитель 0,05-5,0
Вода Остальное
Защитная белковая среда может иметь состав, мас. сахароза 1-12, желатина 0,7-5, агар-агар 0,02-0,1. В качестве растворителя может быть использован диметилсульфоксид и этанол. В научной технической, патентной и другой литературе отсутствуют данные о подобных составах для хранения бактерий.

Неизвестны факты пригодности 7,7-диметил-2-фенил-4-/4¹-метоксифенил/-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолина как компонента криопротекторной среды. Это не только неочевидное более того - неожиданное свойство данного соединения. Увеличение срока хранения бактерий до 15-42 лет обусловило положительный эффект изобретения.

Таким образом, данное решение соответствует критериям изобретения.

Предлагаемый состав для хранения бактерий приготавливают следующим образом (расчет на 1 л воды). 0,2-1 г агар-агара замачивают в 0,7 л дистиллированной воды: ставят на огонь: при постоянном помешивании добавляют предварительно замоченный разбухший желатин (7-50 г). После растворения желатина добавляют сахарозу (10-120 г), доводят до кипения. Снимают с огня и доводят объем до 1 л дистиллированной водой, фильтруют, разливают в посуду и стерилизуют при 110^oC 30 мин. Затем в полученную смесь вводят 7,7-диметил-2-фенил-4-/4¹ -метоксифенил/-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин, выполняющего роль криопротектора, растворенный в диметилсульфоксиде или этаноле. 7,7-диметил-2-фенил-4-/4¹-метоксифенил/-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин получен методом гетероциклизации оксо-1,5-дикетоно-5,5-диметил-2-[1-фенил-3/4¹-метоксифенил/-3-- оксопропил] -циклогексан-1,3-диона с азотистыми реагентами (Казаринова Т.Д. Маркова Л.И. Харченко В.Г. 5-оксогексагидрохинолины конденсированные аналоги 1,4-дигидропиридинов. Получение и свойства.// Химия гетероциклических соединений, 1990, N 4, с. 511-514). В качестве азотистых реагентов можно использовать аммиак (выход продукта составляет 66%), либо ацетат аммония (выход продукта составляет 10%).

Состав и строение полученного оксогидрохинолина было подтверждено данными элементного анализа и ИК-спектроскопии. Образец соединения, используемого в данных исследованиях, был идентифицирован по температуре плавления пробы смешивания с образцом, полученным ранее.

Криопротективную активность вещества предварительно оценивали приборным методом на хемилюминометре LKB-(Nallac 1251, основанном на оценке активности перекисных радикалов в системе свободно-радикального окисления, инициированного перекисью водорода. Тестируемое вещество показало высокую активность.

Пример 1. Вакцинный штамм чумного микроба EV представитель широко распространенного в природе семейства Enterobacteriaceae выращивали в оптимальном температурном режиме на скошенном агаре Хоттингера до стационарной фазы роста и суспендировали в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара c добавлением 0,001-0,1% 7,7-диметил-2-фенил-4-/4¹-метоксифенил/-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолина, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде или 96% этаноле. Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали. В результате проведенных экспериментов установлено, что 7,7-диметил-2-фенил-4-/4¹-метоксифенил/-5-оксо-1,4,5,6,7,8 -гексагидрохинолин в указанных выше концентрациях увеличивает продолжительность хранения живой чумной вакцины EV в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток c 10 лет (в контроле) до 17-42 лет в зависимости от концентрации, то есть в 1,7-4,2 раза.

Пример 2. Вакцинный штамм Br.abortus 19А представитель семейства Brucellaceae с неясным систематическим положением выращивали в оптимальном температурном режиме на скошенном питательном агаре, приготовленном из сухого концентрата (г. Оболенск Московская область) до стационарной фазы роста и суспендировали в среде состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара с добавлением 0,001-0,1% 7,7-диметил-2-фенил-4-/4¹-метоксифенил/ -5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолина, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО) или этаноле. Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали. В результате проведенных экспериментов установлено, что 7,7-диметил-2-фенил-4-/4¹-метоксифенил/-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин в указанных выше концентрациях увеличивает продолжительность хранения вакцинного штамма Br. abortus 19А в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 7,3 лет (в контроле) до 25,6-34,8 лет в зависимости от концентрации, то есть в 3,5-4,8 раза.

Использование: биотехнология, микробиология, в частности, лиофилизация, защитная среда, хранение микроорганизмов. Сущность изобретения: состав хранения бактерий содержит защитную белковую среду 7,7-Диметил-2-фенил-4-4¹-метоксифенил/-5-оксо-1,4,5,6,7,8. - гексагидрохинолин, его растворитель и воду, при определенном соотношении компонентов. Защитная белковая среда может иметь состав, мас.%: сахароза - 1-15, желатина - 0,5-5, агар-агар -0,01-0,2. В качестве растворителя может быть использован диметилсульфоксид и этанол. 3 з.п. ф-лы.

1. Состав для хранения бактерий, включающий защитную белковую среду и воду, отличающийся тем, что он дополнительно содержит 7,7-диметил-2-фенил-4-(4¹-метоксифенил)-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин и его растворитель при следующем соотношении компонентов, мас.

Защитная белковая среда 1,5 20,0
7,7-Диметил-2-фенил-4-(4¹-метоксифенил)-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин - 0,001 0,1
Растворитель 0,05 5,0
Вода Остальное
2. Состав по п.1, отличающийся тем, что защитная белковая среда имеет состав, мас.

Сахароза 1 15
Желатина 0,5 5,0
Агар-агар 0,01 0,2
3. Состав по п.1, отличающийся тем, что в качестве растворителя 7,7-диметил-2-фенил-4-(4¹-метоксифенил)-5-оксо-1,4,5,6,7,8--гексагидрохинолина содержит диметилсульфоксид.