Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской и научно-исследовательской микробиологии.
Штамм чумного микроба Yerslnla pestls А-1567 выделен от блох большой песчанки, отловленной в 120 км северо-восточнее поселка Баканас. Штамм получают прямым посевом биологического материала на агаровые пластинки среды Хоттингера при 28° С. На вторые сутки инкубации отмечается типичный рост возбудителя чумы.
Штамм А-1567 характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки: штамм А-1567 имеет типичные для возбудителя чумы культурально-морфологические и другие свойства. Он растет в R-фор- ме на обычных питательных средах (бульон и агар Хоттингера, среда Мартена, обычный питательный агар, среда Эндо, дрожжевая среда, гидролизаты казеина и желатина).
Диаметр колоний при изолированном росте на среде Хоттингера на 2-3 сутки 2-3 мм, на пятые - 2-8 мм (при 28°С выращивания).
Оптимальная температура роста 27- 28°С, минимальная (еле заметный рост на 3 сутки) - + 2°С, максимальная - +40°С. На среде Джексона-Берроуза растет в виде популяций, состоящих из пигментированных (pgm+) колоний. На жидких питательных средах характер роста типичен для чумного микроба. В мазках выявляются грамотрица- тельиые биполярные палочки.
Питательные потребности штамма. Штамм растет при 28°С на среде следующего состава, г/л; глюкоза 3;,двузамещенный фосфорнокислый калий 7; однозамещенный фосфорнокислый калий 2; цитрат натрия 0,5; сернокислая магнезия 0,1; сульфит натрия 0,5; цистеин 0,05; фенилаланин 0,05; метионин 0,05; треонин 0,05 (аминокислоты в L- и DL-форме), дистиллированная вода 1
DO О Я
W
1 ел
л (в случав приготовления плотных питательных сред добавляют 30 г агар-агара).
Физиолого-биохимические признаки. Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, маннит, арабинозу, маннозу, ксилозу, глицерин. Не ферметиру- ет лактозу, сахарозу, рамнозу. дульцит, эритрит, мелибйозу целлобинозу. Дает отрицательные реакции денитрификации и нитрификации. Имеет / -галактозидазу. Реакция Фогес-Проскауэра положительная. Не имеет фермента уреазы, оксидазы, ре- дуктазы тетратионата, амилазы, декарбок- силазы лизина и дегидролазы аргинина. Желатин не разжижает, не расщепляет ма- лоната и тартрата натрия. Кальцийзависи- мый. На среде Хигучи-Смита мутирует в кальцийнезависимые клетки fCa4} с низкой частотой (2-8 х 10 4-7-8 х ).
Отношение к гомо- и гетерологичным штаммам. Высокочувствителен к диагностическим чумному и псевдотуберкулезному фагам и фагу Л-413 С.
Отношение штамма к видовым диагностическим сывороткам. Аглютинируется противочумной сывороткой в титре 1 : 1200.
Антигенные свойства штамма. Обладает антигенами fra, ina, Tox.
Чувствительность к антибиотикам. Высокочувствителен к стрептомицину, рифам- пицину, гентамицину, пенициллину, мономицину, тетрациклину, хлорамферико- лу, хлортетрациклину.
Генетические особенности штамма. Штамм ауксотрофен. Имеет обычные для возбудителя чумы плазмиды pPst, pCad (pVIr), pFra Tox и дополнительную плазмиду мол. м. 20 мДа.
Вирулентные свойства. Штамм А-1567 высоковирулентен для лабораторных животных - морские свинки погибают от 10 , а белые мыши - от 102 микробных клеток при подкожном методе заражения.
Условия хранения. Штамм хранится в запаянных пробирках на косячках среды Хоттингера в холодильнике (3-10°С).
Условия выявления продуктов жизнедеятельности штамма. Для выявления токсина и антигенной фракции 1 может быть использована среда Хоттингера (температура инкубации - 37°С). Для выявления пигментсорбции используют среду Джексо- на-Бэрроуза в обычной прописи.
Пример. Культуру штамма и кишечной палочки выращивали в течение суток на
0 агаре Хоттингера (рН 7.2), затем снимали клетки с площади 1 см2 и суспендировали в 200 мл буфера, содержащего 50 мМ Триса, 2,5 % додецилсульфата натрия и NaOH (до рН 12,5). Образцы помещают в водяную ба5 ню при 68°С на 30 мин. Добавляют равный объем смеси фенол-хлороформ (1 : 1) и тщательно перемешивают. Центрифугируют в течение 5 мин при 15 тыс, об/мин. Водяную фазу смешивают с 1/10 объема буфера и наносят в лунки 0,6 %-ного агарозного геля. Электрофорез проводят в горизонтальных пластинах геля в буфере ТВЕ: 69 мМ триса, 89 мМ НзВОз, 2,5 мМ Na2 - ЭДТА. Постоянное напряжение 100 В, продолжительность
5 электрофореза 3,5 ч. В качестве маркеров мол. м. используют плазмиды E.coli: pCRI (7,5 МДа), pRK290 (13мДа), pSa (23 мДа), R6K (26 мДа), RP4 (37 мДа). В результате эксперимента выявляют наличие дополнительной плазмиды у штамма А-1567. Мол. м. плазмиды составляет 20 мДа.
Таким образом, новый штамм возбудителя чумы, содержащий дополнительную плазмиду мол. м. 20 мДа, может быть использован в качестве генетического зонда при идентификации и детекции штаммов возбудителя чумы, выделенных из различных природных очагов.
0
0
5
40
Формула изобретения
Штамм чумного микроба Yerslnla Pestls КМ-939, используемый в качестве тест-объекта для определения строения и функции новой дополнительной плазмиды возбудителя чумы.
Использование: биотехнология, медицинская микробиология, генетика микроорганизмов. Сущность изобретения: получение нового штамма-чумного микроба Yerslnla pestls, имеющего дополнительную плазмиду мол. м. 20 мДа. Штамм выделен от блох большой песчанки, отловленной в 120 км северо-восточнее поселка Баканас. Он имеет типичные для возбудителя чумы культурально-морфологические и другие свойства и может быть использован в качестве генетического зонда при идентификации и детекции штаммов возбудителя чумы, выделенных из различных природных очагов.
