СОСТАВ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ БАКТЕРИЙ Российский патент 1995 года по МПК C12N1/04 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к хранению микроорганизмов, и может быть использовано в научной и практической медицине, в биотехнологии для хранения штаммов-продуцентов различных веществ.

Известны составы сред, применяемые при консервировании микроорганизмов. Среда "Mistdissieans" [1] содержащая 7,5% глюкозы, 3 ч нормальной лошадиной сыворотки и 1 ч. бульона.

Недостатком данной среды следует признать отсутствие стандартности ее приготовления в силу присутствия в ней лошадиной сыворотки и бульона, приготовленного из сырья различного качества.

Сахарозо-желатиновая среда (Данилова М.В. Надирова И.М. Кудрявцев В.И. Лиофилизация бактерий. В кн. "Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов". М. Наука. 1967. с. 131), содержащая 10% сахарозы и 0,1% агара в 1,5% желатине.

Недостатком данной среды является невозможность хранения различных бактериальных штаммов в течение длительного времени.

Известен также способ консервирования клеток Fusarium moniliforme Pg-7 [2] cодержащий в качестве криопротектора 1-3%-ный раствор сахарозы, или 1-5% -ный раствор диметилсульфоксида, или 1-3%-ный раствор глицерина.

Недостатком данного способа является узкий спектр применения: один вид клеток Fusarium moniliforme Pg-7, хранящийся в условиях замораживания при низкой температуре.

Наиболее близким к предлагаемому является состав защитной среды [3] используемый для лиофильного высушивания культур чумного микроба, псевдотуберкулеза и других микробов. Среда содержит 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара.

Недостатком данной среды является весьма короткий промежуток времени хранения культур, что заставляет повторять процесс лиофилизации, проводить посевы, ведущие к утрате отдельных свойств штамма.

Целью изобретения является увеличение продолжительности хранения культур.

Сущность изобретения в том, что в состав для хранения бактерий, содержащий водный раствор защитной белковой среды и криопротектор, введен 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин, растворитель при следующем соотношении компонентов, мас.

Защитная белковая
среда 1,7-18
2,4-Дифенил-5-оксо-
1,4,5,6,7,8-
гексагидрохинолин 0,0005-0,025
Растворитель 0,1-5,0
Вода Остальное
В качестве растворителя может быть использован диметилсульфоксид. Защитная белковая среда может иметь состав, мол. сахароза 1-12; желатина 0,7-5, агар-агарa 0,02-0,1. В научной, технической, патентной и другой литературе отсутствуют данные о подобных составах для хранения бактерий.

Неизвестны факты пригодности 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохиноли- на как компонента криопротекторной среды. Это не только неочевидное, более того неожиданное свойство данного соединения. Увеличение срока хранения бактерий до 4,4-5,1 года обусловило положительный эффект изобретения.

Таким образом, данное решение соответствует критериям изобретения.

Заявляемый состав для хранения бактерий приготавливают следующим образом (расчет на 1 л воды). 0,2-1 г агар-агара замачивают в 0,7 л дистиллированной воды, ставят на огонь, при постоянном помешивании добавляют предварительно замоченный разбухший желатин (7-50 г). После растворения желатины добавляют сахарозу (10-120 г), доводят до кипения. Снимают с огня и доводят объем до 1 л дистиллированной водой, фильтруют, разливают в посуду и стерилизуют при 110^оС 30 мин. Затем в полученную смесь вводят 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин, растворен- ный в диметилсульфоксиде.

2,4-Дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гекса- гидрохинолин получен методом гетероциклизации оксо-1,5-дикетона-2-(1,3-дифенил-3-оксопропил)-циклогександиона-1,3 с азотистыми реагентами (Т.Д.Казаринова, Л.И.Маркова, В.Г.Харченко. 5-оксогексагидрохинолины конденсированные аналоги 1,4-дигидропиридинов. Получение и свойства. Химия гетероциклических соединений. 1990. N 4. с. 511-514). В качестве азотистых реагентов можно использовать аммиак) выход продукта составляет 90% либо ацетат аммония (выход продукта составляет 83%).

Состав и строение полученного оксогидрохинолина было подтверждено данными элементного анализа и ИК-спектроскопии. Образец соединения, используемого в данных исследованиях, был идентифицирован по температуре плавления пробы смешивания с образцом, полученным ранее.

П р и м е р 1. Вакцинный штамм чумного микроба ЕУ выращивали в оптимальном температурном режиме на скошенном агаре Хоттингера до стационарной фазы роста и суспензировали в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара с добавлением 0,0002-0,0025% 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохино- лина, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО). Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали. В результате проведенных экспериментов установлено, что 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин в указанных выше концентрациях увеличивает продолжительность хранения живой чумной вакцины ЕУ в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 4 лет (в контроле) до 4,4-5,1 года в зависимости от концентрации, т.е. в 1,1-1,3 раза.

П р и м е р 2. Изучение влияния защитной среды с 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолином на продолжитель- ность хранения микроорганизмов вида V.cholerae в лиофилизированном состоянии проведено на 4 штаммах биоваров cholerae, eltor, сероваров Ogawa, Inaba.

Штаммы выращивали на скошенном агаре Хоттингера рН 7,6 в оптимальном температурном режиме до стационарной фазы роста и суспензировали в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара с добавлением 0,0002-0,0025% 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидро- хинолина, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО). Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали. В результате проведенных экспериментов установлено, что 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин в указанных выше концентрациях увеличивает продолжительность хранения штаммов холерного вибриона в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 2,5 лет (в контроле) до 2,9-4,7 года в зависимости от концентрации, т.е. в 1,2-1,8 раза.

П р и м е р 3. Изучение влияния защитной среды с 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолином на продолжительность хранения микроорганизмов Bac. anthracis в лиофилизированном состоянии проведено на 1-м штамме возбудителя сибирской язвы.

Штамм выращивали на агаре Хоттингера, рН 7,2 при 37^оС до стационарной фазы роста (18-24 ч). Суспензию готовили в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара с добавлением 0,0002-0,0025% 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолина, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО). Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали.

В результате проведенных экспериментов установлено, что 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин в указан- ных выше концентрациях увеличивает продолжительность хранения штаммов сибиреязвенного микроба с 5,9 лет в контроле до 7,0-9,0 лет, т.е. в 1,2-1,5 раза.

П р и м е р 4. Изучение влияния защитной среды с 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолином на продолжительность хранения микроорганизмов Francisella tularensis в лиофилизированном состоянии проведено на 1-м штамме туляремийного микроба.

Штамм выращивали на рыбно-дрожжевом агаре, рН 7,0 при температуре 37^оС до стационарной фазы роста (42-48 ч). Суспензию готовили в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара с добавлением 0,0002-0,0025% 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолина, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО). Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали.

В результате проведенных экспериментов установлено, что 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин в указанных выше концентрациях увеличивает продолжительность хранения штамма возбудителя туляремии с 1,9 года (в контроле) до 2,5-5,5 лет в зависимости от концентрации, т.е. в 1,3-2,8 раза.

П р и м е р 5. Изучение влияния защитной белковой среды с 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолином на про- должительность хранения микроорганизмов Brucella melitensis и Brucella abortus в лиофилизированном состоянии проведено на 2 штаммах возбудителя бруцеллеза.

Штамм бруцелл выращивали на эритрит-агаре, рН 7,0 при 37^оС до стационарной фазы роста (42-48 ч). Суспензию микроорганизмов готовили в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара с добавлением 0,0002-0,0025 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолина, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО). Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали.

В результате проведенных экспериментов установлено, что 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин в указанных выше концентрациях увеличивает продолжительность хранения штаммов бруцелл с 3,8 лет (в контроле) до 4,4-4,8 лет в зависимости от концентрации, т.е. в 1,2-1,3 раза.

П р и м е р 6. Изучение влияния защитной среды с 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолином с применением в качестве растворителя метанола проводили на модели представителя семейства Enterobacteriaceae-вакцинном штамме чумного микроба ЕУ.

Штамм выращивали на скошенном агаре Хоттингера рН 7,2 в оптимальном температурном режиме до стационарной фазы роста и суспензировали в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатины и 0,1% агар-агара с добавлением 0,0050% 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохиноли- на, растворенного в 0,1% метаноле. Полу- ченную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали.

В результате проведенных экспериментов установлено, что 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин в указанной выше концентрации увеличивает продолжительность хранения вакцинного штамма чумного микроба ЕУ в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 2,2 лет (в контроле) до 2,6 лет, т.е. в 1,2 раза.

П р и м е р 7. Изучение влияния защитной среды с 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолином с применением в качестве защитной белковой среды нормальной лошадиной сыворотки и бульона Хоттингера рН 7,2 (3:1) проводили на представителе семейства Enterobacteriaceae-штамме Y.pestis ЕУ.

Штамм выращивали на скошенном агаре Хоттингера рН 7,2 в оптимальном температурном режиме до стационарной фазы роста и суспензировали в среде, состоящей из нормальной лошадиной сыворотки и бульона Хоттингера рН 7,2 (3: 1) в соотношении 1,7-18 мас. к общему составу с добавлением 0,0050% 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолина, растворенного в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО). Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали.

В результате проведенных экспериментов установлено, что и в новой защитной белковой среде добавление 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолина в указанной выше концентрации увеличивает продолжительность хранения вакцинного штамма чумного микроба с сохранением 50% жизнеспособных клеток с 4,1 лет (в контроле) до 7,1 лет, т.е. в 1,7 раза.

Использование: микробиология, хранение микроорганизмов. Сущность изобретения: состав для хранения бактерий содержит водный раствор защитной белковой среды, 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексахолин, его растворитель при определенном соотношении компонентов. В качестве растворителя может быть использован диметилсульфоксид или спирт. Состав увеличивает продолжительность хранения культур. 2 з.п.ф-лы.

1. СОСТАВ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ БАКТЕРИЙ, включающий защитную белковую среду и воду, отличающийся тем, что он дополнительно содержит 2,4-дифенил-5-оксо-1, 4, 5, 6, 7, 8-гексагидрохолин и его растворитель при следующем соотношении компонентов, мас.

Защитная белковая среда 1,7 18,8
2,4-Дифенил-5-оксо-1, 4, 5, 6, 7, 8-гексагидрохолин 0,005 0,025
Растворитель 0,1 5,0
Вода Остальное
2. Состав по п.1, отличающийся тем, что в качестве растворителя он содержит диметилсульфоксид.

Сахароза 1 12
Желатина 0,7 5,0
Агар-агар 0,02 0,1
2,4-Дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин 0,0005 0,025
Растворитель 0,1 5,0
Вода Остальное