Питательная среда для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/44 

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков в пищевых продуктах, клиническом материале и других объектах.

Для бактериологического контроля в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации XII издание, регламентирующей перечень питательных сред для выявления Staphylococcus aureus, рекомендовано использование агара Фогель-Джонсона (Vogel-JohnsonAgarMedium) ОФС 42-0067-07.

Ведущими зарубежными фирмами Merck «Микробиология, 2004/2005, стр. 102), HiMedia (HiMedia LaboratoriesPvt. Limited (Индия), 1993, стр. 241, Fluka (Scientifi cresearch 2005/2006, стр. 1858) и др. выпускаются: основа агара для стафилококков (по Вогелу-Джонсону),Vogel-Johnson Agar Base (V.J. Agar) нa основе гидролизатов казеина, дрожжевого экстракта и маннита. Высокая селективность сред обусловлена наличием хлорида лития и теллурита калия, а наличие в средах глицина и маннита компенсирует их ингибирующее действие на S. aureus.

В России нет коммерческой сухой питательной среды для выявления патогенных маннитположительных стафилококков. Данное изобретение относится к дифференциально-диагностическим питательным средам, является аналогом агара Фогель-Джонсона, может быть использовано в клинической и санитарной микробиологии.

Белковая основа и дрожжевой экстракт являются в среде источниками азотистых питательных веществ, углерода, серы, витаминов группы В и микроэлементов. Фосфат калия обеспечивает буферные свойства среды, а высокая селективность обусловлена наличием хлорида лития и теллурита калия, которые вместе с гидролизатом казеина неглубокой степени расщепления, в течение первых 24 ч инкубации подавляют рост почти всех сопутствующих микроорганизмов. Возможное угнетение роста стафилококков на данной среде компенсируется наличием маннита и глицина. Стафилококки восстанавливают теллурит-анионтеллуритредуктазой и образуют колонии черного цвета. У патогенных коагулазоположительных стафилококков наблюдается четкая корреляция между восстановлением теллурита и ферментацией маннита с образованием кислоты, что выявляется по изменению цвета индикатора, содержащегося в среде, с красного на желтый.

Стафилококки-сапрофиты (S. epidermidis и S. intermedins) образуют серо-черные колонии, но не ферментируют маннит.

До настоящего времени в России для выделения стафилококков используются: элективно-солевой агар, стафилококкагар и питательная среда №10 различных производителей. Коммерческий выпуск сухого питательного агара для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков в РФ отсутствует. Компонентный состав агара для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков различных фирм производителей в г/л представлен в таблице 1.

Для приготовления коммерческой среды навески ингредиентов размешивают в 1 л дистиллированной воды. Среда стерилизуется автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Затем, после охлаждения до температуры 45°С, асептично добавляют 20 мл стерильного 1%-ного раствора теллурита калия.

Биохимическая характеристика коммерческих сухих питательных агаров для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков представлена в таблице 2.

Аминный азот в растворе глицина с концентрацией 10,0 г/л составляет 218 мг/%, или 2,18% в сухом препарате. Учитывая, что в коммерческих препаратах фирм Biolife и Fluka суммарное значение аминного азота глицина, белковой основы и дрожжевого экстракта составляет 4,3% и 2,9% соответственно, следует вывод:

1. О несоответствии расчетных данных по аминному азоту в среде Vogel-Johnson Agar фирмы Fluka с экспериментально установленным содержанием аминного азота, что указывает на некорректный компонентный состав среды этой фирмы (содержание глицина в среде ниже заявленного).

2. Рост стафилококков подавляется при добавлении во все импортные среды, регламентированного в инструкциях по приготовлению, 20,0 мл/л 1%-ного раствора теллурита калия или 10,0 мл/л 2%-ного раствора теллурита калия.

Техническим результатом изобретения является создание отечественной сухой питательной среды для выявления патогенных маннитположительных стафилококков, обладающей стабильностью результатов, сбалансированностью по питательным потребностям стафилококков, обеспечивающей ингибицию сопутствующей микрофлоры и выявление факторов патогенности при диагностике заболеваний, вызванных стафилококками. Технический результат достигается сбалансированностью компонентного состава среды в экспериментально установленных концентрациях с использованием в основном сырья отечественного производства. Среда содержит: панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления (ТУ 9385-075-78095326-2007), пептон мясной, дрожжевой экстракт, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, маннит, литий хлористый, глицин, феноловый красный и агар при следующем соотношении сухих компонентов, г/л:

Панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления 12,0-18,0 Пептон мясной 2,0-4,0 Дрожжевой экстракт 3,0-7,0 Калий фосфорнокислый двузамещенный 4,0-6,0 Маннит 7,0-13,0 Литий хлористый 2,5-3,5 Глицин 4,0-6,0 Феноловый красный 0,02-0,03 Натрий хлористый 2,0-4,0 Агар 9,0-15,0 рН 7.2±0.2 Теллурит калия 2%-ный раствор 5,0 мл

Для приготовления среды навески ингредиентов размешивают в 1 л дистиллированной воды и стерилизуют автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Затем, после охлаждения среды до температуры 45°С, асептично добавляют 5,0 мл стерильного 2%-ного раствора теллурита калия (ТУ 9385-025-78095326-2007).

Отличием предлагаемой среды от прототипа является использование в качестве белковой основы панкреатического гидролизата казеина неглубокой степени расщепления. Наиболее распространенным показателем степени гидролиза белка является отношение массовой доли аминного азота к массовой доле общего азота. Для триптона и пептона казеинового это соотношение составляет не менее 30%, при содержании NaM - (3,5-4,0)% и Nобщ - (11,0-12,0)%, а для панкреатического гидролизата казеина невысокой степени расщепления - не более 23%, при содержании NaM - (2,2-2,5)% и Noбщ - (10,0-10,5)%. Так как содержание свободных аминокислот находится в линейной зависимости от содержания аминного азота, а гидролизаты содержат еще свободные аминогруппы пептидов и белков, следовательно, при меньшей степени расщепления идентичного белкового сырья уровень свободных аминокислот будет ниже, а пептидов и белков выше. Таким образом, панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления обеспечивает ростовые потребности стафилококков, обладающих протеолитической активностью, но в значительной мере уменьшает скорость роста сопутствующих микроорганизмов. С целью поддержания уровня осмотического давления для сохранения жизнедеятельности микроорганизмов среда дополнительно содержит натрий хлористый. Определено количественное соотношение основных компонентов питательной среды, обеспечивающих рост патогенных стафилококков и стафилококков-сапрофитов с ингибирующим эффектом в отношении сопутствующей микрофлоры. В течение культивирования на данной питательной среде полностью отсутствует рост других бактерий, поэтому возможно проводить густой посев исследуемого материала.

Для достижения этих целей и получения питательной среды для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков в клиническом материале и других объектах, сухие ингредиенты смешивают в экспериментально установленных пропорциях.

Пример 1. Для приготовления среды берут навески следующих ингредиентов, г/л:

Панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления 12,0 Пептон мясной 2,0 Дрожжевой экстракт 3,0 Калий фосфорнокислый двузамещенный 4,0 Маннит 7,0 Литий хлористый 2,5 Глицин 4,0 Феноловый красный 0,02 Натрий хлористый 2,0 Агар 9,0 рН 7.2±0.2 Теллурит калия 2%-ный раствор 5 мл

Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, стерилизуют автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Охлаждают до температуры 40-50°С, асептично добавляют 5,0 мл стерильного 2%-ного раствора теллурита калия и разливают в чашки Петри. Перед посевом чашки подсушивают при комнатной температуре, соблюдая правила асептики в течение 40-60 мин.

Предлагаемая среда, обеспечивает рост следующих тест-штаммов при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10^-6:

S. aureus «Виотко»

S. aureus Wood-46

S. aureus 6538-P S. saprophyticusCCM 883 S. epidermidis ATCC 14990 и ингибицию при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого из тест-штаммов: Р. mirabilis 3177, P. vulgaris НХ 19 222, Е. faecalis ATCC 19433, P. aeruginosa 27/99, E. coli ATCC 25922, S. typhimurium 79, E. coli 3912/41 (055:K59) и B. subtilis 6633 из разведения 10^-4 через 48 часов инкубации посевов при температуре (37±1)°С.

При этом ферментирующие маннит стафилококки образуют на среде черные колонии, окруженные желтой зоной, а не ферментирующие маннит стафилококки - черные колонии без пожелтения среды вокруг, диаметром 1,0-3,0 мм.

Результаты биологического контроля представлены в табл. 3.

Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления 15,0 Пептон мясной 3,0 Дрожжевой экстракт 5,0 Калий фосфорнокислый двузамещенный 5,0 Маннит 10,0 Литий хлористый 3,0 Глицин 5,0 Феноловый красный 0,025 Натрий хлористый 3,0 Агар 12,0 рН 7.2±0.2 Теллурит калия 2%-ный раствор 5 мл

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления 18,0 Пептон мясной 4,0 Дрожжевой экстракт 7,0 Калий фосфорнокислый 2-замещенный 6,0 Маннит 13,0 Литий хлористый 3,5 Глицин 6,0 Феноловый красный 0,03 Натрий хлористый 4,0 Агар 15,0 рН 7.2±0.2 Теллурит калия 2%-ный раствор 5 мл

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления 9,0 Пептон мясной 1,0 Дрожжевой экстракт 1,0 Калий фосфорнокислый двузамещенный 3,0 Маннит 4,0 Литий хлористый 2,0 Глицин 3,0 Феноловый красный 0,015 Натрий хлористый 1,0 Агар 7,0 рН 7.2±0.2 Теллурит калия 2%-ный раствор 5 мл

Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды ведет к резкому ухудшению ростовых свойств агара для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков в отношении стафилококков и ингибирующих свойств к микробам ассоциантам.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3.

Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления 21,0 Пептон мясной 5,0 Дрожжевой экстракт 8,0 Калий фосфорнокислый двузамещенный 7,0 Маннит 16,0 Литий хлористый 4,0 Глицин 7,0 Феноловый красный 0,035 Натрий хлористый 5,0 Агар 17,0 рН 7.2±0.2 Теллурит калия 2%-ный раствор 5 мл

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и показывают ухудшение ростовых свойств питательной среды для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков.

Из таблиц видно, что предлагаемая питательная среда в соответствии с примерами 1, 2, 3 обладает высокой чувствительностью, стабильностью ростовых свойств в отношении стафилококков, подавляет рост сопутствующих микроорганизмов.

Изменение количественного соотношения компонентов предлагаемой среды ведет к нарушению биологических показателей качества питательной среды для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков.

Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 4, 5 наблюдается снижение чувствительности среды, выраженное в изменении количества и диаметра выросших колоний контрольных штаммов стафилококков, а также ухудшение ингибирующих свойств в отношении сопутствующей микрофлоры, при концентрации компонентов ниже минимальных параметров.

Таким образом: по сравнению со средой прототипом Vogel-Johnson Agar фирмы Fluka предлагаемая питательная среда имеет ряд преимуществ:

- в качестве белковой основы используют панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления, который обеспечивает ростовые потребности стафилококков, обладающих протеолитической активностью, но в значительной мере уменьшает скорость роста сопутствующих микроорганизмов;

- среда содержит в качестве стимулятора роста стафилококков, обладающих различными питательными потребностями, пептон мясной ферментативный;

- содержание глицина составляет 5,0 г/л вместо 10,0 г/л, заявленных в коммерческих аналогах, что способствует снижению себестоимости среды без ухудшения чувствительности;

- уменьшена концентрация 2%-ного раствора теллурита калия до 5,0 мл/л, что также способствует снижению себестоимости среды без ухудшения ингибиторных и дифференциально-диагностических свойств.

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для селективного обнаружения патогенных маннитположительных стафилококков в пищевых продуктах, клиническом материале и других объектах. Питательная среда содержит панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления, пептон мясной, дрожжевой экстракт, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, маннит, литий хлористый, глицин, феноловый красный, 2%-ный раствор теллурита калия и агар в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить чувствительность питательной среды в отношении маннитположительных стафилококков. 2 табл., 5 пр.

Питательная среда для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков сухая, содержащая белковую основу, калий фосфорнокислый двузамещенный, дрожжевой экстракт, маннит, литий хлористый, глицин, феноловый красный, агар, теллурит калия, отличающаяся тем, что в качестве белковой основы использован панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления, дополнительно она содержит натрий хлористый, пептон мясной при следующем соотношении компонентов, г/л:

Панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления 12,0-18,0 Пептон мясной 2,0-4,0 Дрожжевой экстракт 3,0-7,0 Калий фосфорнокислый двузамещенный 4,0-6,0 Маннит 7,0-13,0 Литий хлористый 2,5-3,5 Глицин 4,0-6,0 Феноловый красный 0,02-0,03 Натрий хлористый 2,0-4,0 Агар 9,0-15,0 pH 7.2±0.2 Теллурит калия 2%-ный раствор 5 мл