ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГОНОКОККА Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12Q1/04 C12R1/36 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при диагностике гонореи.

Ведущими зарубежными фирмами ("Oxoid", "Gibco", "BBL" и др.) выпускаются питательные среды для культивирования гонококка на основе мясных переваров и ферментолизатов с добавлением стерильной нативной крови (1 4).

Из отечественных препаратов известны питательная среда "Аргинин-агар", диагностическая, сухая, производства НПО "Питательные среды" г. Махачкала (5), которая состоит из следующих компонентов, г. пептон 8,0 12,0; аргинин 0,07 0,3; цистин 0,007 0,03; глутаминовая кислота 1,0 1,8; ЭКД 4,0 7,0; тиамин бромид 0,002 0,007; нитрат железа 0,002 0,01; калий хлористый 0,07 0,2; натрий хлористый 5,0 8,0; хлористый аммоний 0,9 2,0; магний сернокислый 0,4 0,9; глюкоза 4,0 7,0; крахмал 0,5 2,0; трис-буфер 1,0 - 2,5; агар 13,0 17,0; бычья сыворотка 153,0 255,0; полимиксина-М сульфат 15000 25000 Ед; линкомицина гидрохлорид 0,001 0,003; вода дистиллированная до 1 л.

Недостатками этой среды являются низкая чувствительность, нестабильность результатов по интенсивности роста гонококка.

Лиофильновысушенная среда для выделения гонококка (производства НИИ ВСа, г. С-Петербург) (6), состоящая из основы среды и добавки при следующем соотношении компонентов, г:
Основа питательной среды:
экстракт кроличьего мяса Вариант (в)1 -1000; вариант2 -500; вариант 3- 1000
экстракт языков крупного рогатого скота (в)2 -500
пептон сухой ферментативный (в)3-10
натрий хлористый (в)1- 5;(в)2- 5; (в)3- 5
автолизат пекарных дрожжей (в)3- 50
кислота оротовая (в)1 -0,00124; (в)2 0,0124; (в)3 -0,00124
агар микробиологический (в)1 25+5; (в)2 25+5; (в)3 25+5
Добавка к основе питательной среды:
сыворотка крупного рогатого скота 200
автолизат пекарных дрожжей 20
гидролизат казеина для парентерального белкового питания 20
Недостатком этой среды является нестабильность результатов по интенсивности роста гонококка и чувствительности.

На практике же в основном применяются лабораторно приготовленные безасцитные среды из экстрактов свежего мяса кроликов и свежих бычьих сердец с добавлением пептона и 20% сыворотки крови крупного рогатого скота или стерильной нативной крови.

Отсутствие необходимого количества отечественных питательных сред для диагностики гонореи, а также качество их вызывает нарекания со стороны практической службы здравоохранения.

Задачей изобретения является создание сухой питательной среды, обеспечивающей стабильность результатов по интенсивности роста и повышенную чувствительность, не уступающей коммерческим средам для диагностики гонококка.

Поставленная задача решается сбалансированностью компонентного состава среды, содержащей питательную основу, автолизат пекарных или пивных дрожжей, агар, хлористый натрий, ингибиторы посторонней микрофлоры линкомицина гидрохлорид и полимиксина-B сульфат, в качестве питательной основы она содержит панкреатический гидролизат рыбной кормовой муки, солянокислотный гидролизат казеина и ферментолизат мясо-костного фарша кроликов, кроме того, она дополнительно содержит стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (ферментативный гидролизат черного альбумина), глюкозу для повышения стабильности результатов при обследовании больных хронической гонореей, возможна добавка к среде сыворотки крови крупного рогатого скота (5 10)% при следующем содержании компонентов, г/л:
панкреатический гидролизат рыбной муки 5,0 7,0
ферментолизат мясо-костного фарша кроликов 12,0 14,0
кислотный гидролизат казеина 2,8 3,2
автолизат пекарных или пивных дрожжей 0,8 1,2
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 2,0 10,0
глюкоза 9,0 11,0
натрий хлористый 2,9 3,1
агар микробиологический 12,0 15,0
полимиксина-B сульфат 15000 25000 Ед
линкомицина гидрохлорид 0,001 0,003
вода дистиллированная до 1 л
pH 7,3 + 0,2
Количественное соотношение компонентов питательной среды и ее рН обеспечивают повышенный уровень интенсивности роста гонококка и чувствительности среды.

Питательную среду готовят следующим образом: навески основных ингредиентов вносят в колбу с дистиллированной водой. Среду тщательно перемешивают и, закрыв колбу ватно-марлевой пробкой, стерилизуют при 115 - 119^oC в течение 30 мин. Затем охлаждают до 45 50^oC и стерильно, предварительно растворив в стерильном физ. растворе, вносят навески полимиксина-B сульфата и линкомицина гидрохлорида. Среду перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

Для биологического контроля питательных сред использовали культуру Neisseria gonorrhoerae музейных штаммов и материал от больных гонореей. Все посевы культивировали при температуре (37 + 0,5)^oC в атмосфере 10% CO₂ и повышенной влажности в течение 24 48 ч. Данные приведены в табл.1.

Пример 1. Проверка предлагаемой среды производилась посевом штаммов Neisseria gonorrhoreae и на клиническом материале на питательную среду следующего состава, г:
панкреатический гидролизат рыбной муки 5,0
ферментолизат мясо-костного фарша кроликов 12,0
солянокислотый гидролизат казеина 2,8
автолизат пекарных дрожжей 0,8
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 2,0
глюкоза 9,0
натрий хлористый 2,9
агар микробиологический 12,0
полимиксина-B сульфат 15000 Ед
линкомицина гидрохлорид 0,001
вода дистиллированная до 1 л
pH 7,3 + 0,2
Учет результатов проводили через 24 48 ч культивирования.

Пример 2. Проверка предлагаемой среды производилась посевом штаммов Neisseria gonorrhoeae и на клиническом материале на питательную среду с оптимальным содержанием компонентов следующего состава, г:
панкреатический гидролизат рыбной муки 6,0
ферментолизат мясо-костного фарша кроликов 13,0
кислотный гидролизат казеина 3,0
автолизат пекарных дрожжей 1,0
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 5,0
глюкоза 10,0
натрий хлористый 3,0
агар микробиологический 13,0
полимиксина-B сульфат 20000 Ед
линкомицина гидрохлорид 0,002
вода дистиллированная до 1 л
pH 7,3 + 0,2
Учет результатов проводили через 24 48 ч культивирования.

Пример 3.

Проверка предлагаемой среды производилась посевом штаммов Neisseria gonorrhoeae и на клиническом материале на питательную среду с максимальным содержанием компонентов следующего состава, г:
панкреатический гидролизат рыбной муки 7,0
ферментолизат мясо-костного фарша кроликов 14,0
кислотный гидролизат казеина 3,2
автолизат пекарных дрожжей 1,2
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 10,0
глюкоза 11,0
натрий хлористый 3,1
агар микробиологический 15,0
полимиксина-B сульфат 25000 Ед
линкомицина гидрохлорид 0,003
вода дистиллированная до 1 л
pH 7,3 + 0,2
Учет результатов проводили через 24 48 ч культивирования.

Пример 4. Проверка предлагаемой среды производилась посевом штаммов Neisseria gonorrhoeae и на клиническом материале на питательную среду с нарушением количественного соотношения компонентов следующего состава, г:
панкреатический гидролизат рыбной муки 10,0
ферментолизат мясо-костного фарша кроликов 17,0
солянокислотный гидролизат казеина 3,4
автолизат пекарных дрожжей 1,4
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 15,0
глюкоза 13,0
натрий хлористый 3,5
агар микробиологический 20,0
полимиксина-B сульфат 30000 Ед
линкомицина гидрохлорид 0,005
вода дистиллированная до 1 л
pH 7,3 + 0,2
Учет результатов проводили через 24 48 ч культивирования.

Пример 5. Проверка предлагаемой среды производилась посевом штаммов Neisseria gonorrheae и на клиническом материале на питательную среду с нарушением количественного соотношения компонентов следующего состава, г:
панкреатический гидролизат рыбной муки 2,0
ферментолизат мясо-костного фарша кроликов 8,0
солянокислотный гидролизат казеина 2,5
автолизат пекарных дрожжей 0,5
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 0,5
глюкоза 5,0
натрий хлористый 2,5
агар микробиологический 10,0
полимиксина-B сульфат 10000 Ед
линкомицина гидрохлорид 0,005
вода дистиллированная до 1 л
pH 7,3 + 0,2
Учет результатов проводили через 24 48 ч культивирования.

Сравнительная характеристика роста гонококков из клинического материала и музейных штаммов на предлагаемой и известных средах через 24 48 ч роста приведена в табл.1.

Морфология колоний и окрашенных мазков на всех испытуемых средах идентична типичная для гонококка.

Из табл.1 видно, что предлагаемая среда по интенсивности роста гонококка и чувствительности превосходит коммерческие среды.

Нарушение количественного соотношения компонентов среды ведет к резкому ухудшению микробиологических показателей качества предложенной среды.

Предлагаемая среда позволяет поддерживать жизнеспособность штаммов Neisseria gonorrhoeae (как свежевыделенных от больных, так и музейных) при пассировании в течение 9 месяцев.

Данные представлены в табл.2.

Из табл. 2 видно, что предлагаемая питательная среда пригодна для диагностических целей при выявлении больных острой и хронической гонореей, а также при получении биомассы Neisseria gonorrhoeae для создания гоновакцин.

Использование: микробиология, диагностика гонореи, питательная среда для выделения и культивирования гонококка. Сущность изобретения: среда содержит в качестве питательной основы панкреатический гидролизат рыбной муки, ферментолизат мясо-костного фарша кроликов и солянокислотный гидролизат казеина, в качестве ингибитора посторонней микрофлоры - полимиксина-B сульфат и линкомицина гидрохлорид, в качестве стимулятора роста и источника витаминов - автолизат пекарных или пивных дрожжей. Среда также содержит стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, натрий хлористый, агар микробиологический и воду дистиллированную. Среда обеспечивает рост музейных штаммов и из материала от больных гонореей, сохраняя типичную морфологию микроорганизма, что способствует широкому применению в практическом здравоохранении при диагностике и лечении венерических заболеваний. 2 табл.

Питательная среда для выделения и культивирования гонококка, содержащая питательную основу, автолизат пекарных или пивных дрожжей, агар микробиологический, натрий хлористый, ингибитор посторонней микрофлоры и воду дистиллированную, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, ферментолизат мясо-костного фарша кроликов и солянокислотный гидролизат казеина, дополнительно содержит стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, глюкозу, а в качестве ингибитора посторонней микрофлоры полимиксина-В сульфат и линкомицина гидрохлорид при следующем соотношении компонентов, г/л:
Панкреатический гидролизат рыбной муки 5,0 7,0
Ферментолизат мясо-костного фарша кроликов 12,0 14,0
Солянокислотный гидролизат казеина 2,8 3,2
Автолизат пекарных или пивных дрожжей 0,8 1,2
Стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 2,0 10,0
Глюкоза 9,0 11,0
Натрий хлористый 2,9 3,1
Агар микробиологический 12,0 15,0
Полимиксина-В сульфат 15000 25000 Ед
Линкомицина гидрохлорид 0,001 0,003
Вода дистиллированная До 1 л
рН 7,3 + 0,2е