ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИСТЕРИЙ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для бактериологической диагностики листериоза.

По данным 2000 года листериоз, поражающий как животных, так и человека, зарегистрирован в 80 странах мира, в том числе и в России /1/. Листериоз - общая проблема для медицинских и ветеринарных специалистов, так как заболеваемость у людей определенным образом связана с животными и продуктами животноводства.

Установить диагноз листериоза по клинико-эпидемиологическим и эпизоотологическим данным исключительно трудно из-за полиморфизма клинических проявлений инфекции. Поэтому решающее значение приобретает лабораторная диагностика с применением специальных селективных питательных сред с целью быстрого обнаружения возбудителя листериоза при контроле мясомолочных продуктов в России и пресечения завоза возбудителя с продуктами питания из-за границы.

В настоящее время для лабораторной диагностики используют мясопептонный агар (МПА) с добавлением глюкозы, теллурита калия и крови крупного рогатого скота и МПА с добавлением теллурита калия, полимиксина /2/.

Недостатками этих сред является их нестабильность, так как эти среды лабораторного изготовления и, кроме того, состоят из дорогостоящих мясных переваров.

Известна дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий, содержащая в качестве источника азота панкреатический гидролизат рыбный /3/.

Недостатком этой среды является нестандартность, так как эта среда лабораторного изготовления и, кроме того, для ее изготовления используются пищевые продукты.

Известна питательная среда для выделения листерий, содержащая в качестве источника азота гидролизат казеина. Среда обладает высокой чувствительностью по отношению к листериям и ингибирует постороннюю микрофлору /4/.

Однако эта среда лабораторного приготовления не стандартна и не доступна широкому кругу потребителей.

Наиболее близкой к предлагаемой является селективная питательная среда для выделения листерий из пищевых продуктов (PALCAMagar) производства bio Merieux /4/, состоящая из следующих компонентов, г/л:
Животный пептон - 23,0
Лития хлорид - 15,0
Крахмал - 1,0
Эскулин - 0,8
Железа аммонийного цитрат - 0,5
Натрия хлорид - 5,0
Акрифлавин - 0,005
Дрожжевой экстракт - 3,0
Декстроза - 0,5
Маннит - 10,0
Феноловый красный - 0,08
Полимиксин - 0,01
Цефтазидим - 0,02
Агар-агар - 10,0
Недостатком этой среды является очень высокая цена и, как следствие, невозможность использования в широкой практической лабораторной сети.

Задачей изобретения является создание промышленной отечественной дифференциально-диагностической среды для выделения листерий с высокими селективными свойствами, стандартной и доступной по цене.

Поставленная задача решается сбалансированностью компонентного состава среды, содержащей источник азота, экстракт пекарных дрожжей, полимиксин, акрифлавин, эскулин, соль железа, лития хлорид, натрия хлорид, агар-агар, в качестве источника азота используются панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ) и панкреатический гидролизат казеина (ПГК), а также содержит налидиксовую кислоту при следующем соотношении компонентов, г/л:
Панкреатический гидролизат рыбной муки - 12,0-18,0
Панкреатический гидролизат казеина - 8,0-12,0
Экстракт пекарных дрожжей - 1,5-2,5
Лития хлорид - 14,0-16,0
Натрия хлорид - 3,0-4,0
Эскулин - 0,7-0,9
Аммонийного железа цитрат (III) - 0,45-0,55
Полимиксина В сульфат - 0,005-0,015
Налидиксовая кислота - 0,015-0,025
Акрифлавин - 0,005-0,015
Агар-агар - 12,0-14,0
Дистиллированная вода - Остальное
Количественное соотношение компонентов, использование в качестве источника азота панкреатических гидролизатов рыбной муки и казеина позволяет получить сухую, стандартную питательную среду, обеспечивающую выделение листерий из инфицированного материала и четкую дифференциацию от сопутствующей микрофлоры.

Селективность среды обеспечивается действием полимиксина В сульфата, акрифлавина и налидиксовой кислоты.

Наличие индикаторной системы (эскулин+соль железа) позволяет легко выявить гидролиз эскулина по образованию черного венчика вокруг колоний листерий.

Пример 1.

Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л:
ПГРМ - 12,0
ПГК - 8,0
ЭПД - 1,5
Лития хлорид - 14,0
Натрия хлорид - 3,0
Эскулин - 0,7
Аммонийного железа цитрат (III) - 0,45
Полимиксина В сульфат - 0,005
Налидиксовая кислота - 0,015
Акрифлавин - 0,005
Агар-агар - 12,0
Дистиллированная вода - Остальное
Навески тщательно перемешивают в 1 л дистиллированной воды, стерилизуют в автоклаве при температуре 121^oС в течение 15 мин и охлаждают до температуры 45-50^oС. В охлажденную среду асептически добавляют антибиотики, размешивают и разливают в стерильные чашки Петри слоем 5-6 мм. Перед использованием чашки со средой подсушивают.

Пример 2.

Эффективность среды проверяли на тест-штаммах Listeria monocytogenes 766, Salmonella choleraesuis ATCC 13312, Escherichia coli 3912/41 (О55:K59), Proteus vulgaris HX 19 222, Staphylococcus aureus "Лоссманов".

Микробную взвесь каждого тест-штамма, приготовленного в стерильном 0,9% растворе натрия хлористого с концентрацией, соответствующей 10 единицам по стандартному образцу мутности, путем десятикратных разведений доводили до концентрации: Listeria monocytogenes 766 до разведения 10^-7, S. choleraesuis ATCC 13312, Е. coli 3912/41 (055:K59), Р. vulgaris HX 19 222 до разведения 10^-2, а S. aureus "Лоссманов" до разведения 10^-5 м.к./мл. На чашку Петри со средой засевали по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма из последних разведений. Посевы инкубировали при температуре 30^oС в течение 48 ч. Учет результатов проводили визуально.

Через 48 ч культивирования колонии L. monocytogenes 766 были круглые, серо-желтые, диаметром 0,2-1,0 мм, окруженные черной зоной; S. choleraesuis ATCC 13312, Е. coli 3912/41 (О55:K59), Р. vulgaris HX 19 222 - роста не было; S. aureus "Лоссманов" - круглые, лимонно-желтого цвета, диаметром 1,0-2,0 мм.

Пример 3.

Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л:
ПГРМ - 18,0
ПГК - 12,0
ЭПД - 2,5
Лития хлорид - 16,0
Натрия хлорид - 4,0
Эскулин - 0,9
Аммонийного железа цитрат (III) - 0,55
Полимиксина В сульфат - 0,015
Налидиксовая кислота - 0,025
Акрифлавин - 0,015
Агар-агар - 14,0
Дистиллированная вода - Остальное
Приготовление и бактериологический контроль среды проводили в соответствии с примерами 1 и 2. Результаты контроля представлены в таблице.

Пример 4.

Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л:
ПГРМ - 15,0
ПГК - 10,0
ЭПД - 2,0
Лития хлорид - 15,0
Натрия хлорид - 3,5
Эскулин - 0,8
Аммонийного железа цитрат (III) - 0,5
Полимиксина В сульфат - 0,01
Налидиксовая кислота - 0,02
Акрифлавин - 0,01
Агар-агар - 13,0
Дистиллированная вода - Остальное
Приготовление и бактериологический контроль среды проводили в соответствии с примерами 1 и 2. Результаты контроля представлены в таблице.

Из таблицы видно, что предлагаемая среда обладает высокой селективностью, хорошими ростовыми свойствами по отношению к листериям и четкой дифференциацией от стафилококков.

Нарушение количественного соотношения компонентов среды ведет к резкому ухудшению показателей качества предложенной среды и затрудняет выделение и дифференциацию листерий.

Таким образом, по сравнению со средой-прототипом предлагаемая дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий имеет ряд преимуществ:
- не содержит дорогостоящих мясных переваров;
- упрощается состав без ухудшения селективных и дифференцирующих свойств;
- позволяет обеспечить производство среды без дополнительных материальных затрат, так как используются промышленно получаемые белковые основы.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ, ПРИНЯТЫЕ ВО ВНИМАНИЕ
1. В.М. Котляров, И.А. Бакулов. Листериоз - нейроинфекция животных и людей. Материалы Международной научно-практической конференции 30-31 мая 2001. Покров, 2001, с.105.

2. Методические рекомендации по лабораторной диагностике листериоза животных и людей. М., 1987, с. 54.

3. RU 99123267 А, 20.09.2001.

4. RU 95109695 А, 10.10.1997.

5. Питательные среды. Каталог bio Merieux. 1996, с. 81-82.

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для бактериологической диагностики листериоза. В качестве источника азота среда содержит богатую питательными веществами основу: панкреатический гидролизат рыбной муки и панкреатический гидролизат казеина, она также содержит экстракт пекарных дрожжей, полимиксина В сульфат, акрифлавин, эскулин, соль железа, лития хлорид, натрия хлорид, агар-агар, налидиксовую кислоту и дистиллированную воду. Индикаторная система (эскулин + соль железа) позволяет легко выявить гидролиз эскулина по образованию черного венчика вокруг колоний листерий. Сбалансированность компонентного состава среды также позволяет полностью ингибировать рост сопутствующей микрофлоры и обеспечивать стабильность, высокую чувствительность среды и эффективность накопления листерий. 1 табл.

Дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий, содержащая источник азота, экстракт пекарных дрожжей, полимиксин, акрифлавин, эскулин, аммонийного железа цитрат (III), лития хлорид, натрия хлорид, агар-агар, отличающаяся тем, что, она дополнительно содержит налидиксовую кислоту и дистиллированную воду, а в качестве источника азота - панкреатический гидролизат рыбной муки и панкреатический гидролизат казеина, в качестве полимиксина - полимиксина В сульфат, при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:

Панкреатический гидролизат рыбной муки 12,0-18,0

Панкреатический гидролизат казеина 8,0-12,0

Экстракт пекарных дрожжей 1,5-2,5

Лития хлорид 14,0-16,0

Натрия хлорид 3,0-4,0

Эскулин 0,7-0,9

Аммонийного железа цитрат (III) 0,45-0,55

Агар микробиологический 12,0-14,0

Полимиксина В сульфат 0,005-0,015

Налидиксовая кислота 0,015-0,025

Акрифлавин 0,005-0,015