Способ получения гидрокортизона Советский патент 1988 года по МПК C12P33/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения стероидных гормонов, а имен :но гидрокортизона.

Цель изобретения - повышение вы- Зсода целевого продукта. - П р и м е р 1. Культуру Curvularia lunata ВКМ F-644 хранят в пробирках на скошенной агаризованной среде еледующего состава, г/л:

Дрозкжевой экстракт4,0

Солодовый экстракт10,0

Глюкоза4,0

Агар30,0

Вода дистиллированная Среду с рН 6,2-6,9 стерилизуют при 1 атм 30 мин. При пересеве гриб выращивают в течение 4 сут при 28 С. Срок хранения культуры - не более месяца.

Споры гриба смывают с поверхности агара стерильной водой, либо средой и вносят в колбы Эрлеимейера объемом 750 МП с 50 мл среды следующего состава, г/л: Сахароза 30,0 Дрожжевой автолизат 2,5 NaNOj 2,0 ( 3,0 KjHPO 1,0 i KCl 0,5 I , 0,5 i Вода дистиллированная, i pH среды 5,0-6,1

i Среду стерилизуют при 1 атм 30 ми 1 Культуру выращивают в течение 48-60 ч при и 220 об./мин. Полученным инокулятом в объеме 10 мп засевают такие же колбы с 50 мл среды и выращивают культуру в указанных условиях. Затем мицелий отфильтровывают, отмывают от питательной среды буфером (0,05 М - NaOH, рН 6,0) и используют для проведения процесса трансформации.

Реакцию трансформации проводят в 50 МП 0,05 М - NaOH-буфера, рН 6,0, куда вносят 5 г отмытого мицелия (0,5 г по- сухому весу) и 0,1 г вещества S Рейхштейна в кристаллической форме (2 г/л), соотношение мицелия (в расчете на сухой вес) и вещества S равно 1:0,2.

Реакционную смесь инкубируют при в условиях перемешивания и аэрации в течение 48-168 ч. Затем из целой реакодонной смеси выделяют гидрокортизон экстракцией хлороформом. Выход целевого продукта в лаборато15ных условиях равен 72,4%, содержание .остальных стероидов: 14в(-оксипроизвод ные вещества S Рейхштейна 5%; 6У, 1Ы-оксипроизводные вещества S 5%.

Пример 2. Выращивание мицелия гриба Curvularia lunata ВКМ F-644 (инокулята), условия иммобилизации инокулята в Са-альгинатный гель, sbipa щивание мицелия в гранулах Са-альги- натного геля описаны в примере 1.

Кристаллический субстрат - вещество S Рейхштейна, вносят в среду для трансформации в концентрации 10 г/л, т.е. 500 мг кристаллического субстрата вносят в 50 МП 0,05 М - NaOH-буфера, рН 6,5, содержащего 0,5 г мицелия (сухой вес) (соотношение 1:1)

Выход гидрокортизона при трансформации вещества s Рейхштейна в концентрации 10 г/л после 7 сут инкубации составляет 55-60%, т.е. 5,5 - 6,0 г/л. Содержание остальных стероидов: I4ei оксипроизводные вещества S Рейхштейна 15-20%, суммарное содержание других побочных продуктов 8-10%.

Для осуществления способа можно использовать иммобилизованный мицелий

Пример 3. Культуру С. lunata ВКМ F-644 (инокулят) выращивают, как описано в примере 1.

Полученный инокулят в объеме 10 мл иммобилизуют в Са-альгинатный гель. С этой целью к 7 мл 6%-ного гомогенного раствора Na-альгината добавляют 3 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия и 10 мл культуральной жидкости Тщательно перемешивают и при помощи шприца или перистальтического насоса по каплям при перемешивании вносят в 1%-ный раствор хлористого кальция. Образующиеся гранулы Са-альгинатного геля ( мм), содержащие мицелий, вьщерживают в 1%-ном растворе хлористого кальция в течение 2ч, отмывают 0,05 М - NaOH-буфером, рН 6,0, и вносят в колбы с 50 мл ростовой среды. Для сохранения гранул в среду добавляют 1 мл 1%-ного раст- .вора CaCl-. Выращивание иммобилизованного инокулята проводят в условиях аналогичных условиям вьфащивания свободного мицелия. После 48-60 ч роста гранулы геля отделяют от среды, промывают буфером и используют для трансформации.

Трансформацию вещества S Рейх- штейна в концентрации 2 г/л проводят при и 220 об./мин.

В колбы Эрленмейера объемом 750 мл с 50 мл 0,05 М - NaOH- буфера, рН 6,0, вносят 16,5 г гранул (сьфой вес), содержащих 5 г иммобилизованного мицелия и 100 мг кристаллического субстрата.

В процессе трансформации из реакционной среды отбирают аликвоты и проводят анализ образующихся стероидных соединений методом ТСХ. Промытые гранулы используют для проведения последующей трансформации.

Максимальное количество гидрокортизона накапливается в среде за 48 ч инкубации субстрата с иммобилизован- 1ШМ мицелием. Выход гидрокортизона составляет 60-65% или 1,2-1,3 г/л. Содержание других стероидов: 14о1-ок- сипроизводное вещество S Рейхштей

на 10-15%, -суммарное содержание других побочных соединений 5%.

Использование предлагаемого способа позволяет повысить выход целевого продукта, упростить его и повысить концентрацию трансформируемого субстрата.

Формула изобретения

Способ получения гидрокортизона, включающий трансформацию вещества .S Рейхштейна с помощью мицелия гриба Curvularia lunata с последующей

экстракцией и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повьшения выхода целевого продукта, вещество S Рейхштейна используют в кристаллическом виде

при соотношении сухого мицелия и вещества S Рейхштейна в реакционной среде 1:0,2-1, а экстракции подвергают реакционную среду с мицелием.

Изобретение относится к микробиологической промьгашенности и может быть использовано для получения стероидных гормонов. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Сущность способа сводится к тому, что осуществляют трансформацию вещества S Рейхштейна с использованием культуры Curvularia lunata. Для этого мицелий и трансформируемый субстрат в кристаллической форме инкубируют в буферной среде при в течение 48-168 ч, при этом соотношение сухо- то мицелия и вещества S Рейхштейна в среде составляет 1:0,2-1, т.е. на 10 г/л сухого мицелия - 2-10 г/л субстрата. Выход целевого продукта 55- 72,4%.