СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 9-АЛЬФА-ОКСИАНДРОСТ-4-ЕН-3,17-ДИОНА Российский патент 1997 года по МПК C12P33/16 C07J1/00 C12P33/16 C12R1/32 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической, микробиологической и химической промышленности при получении полупродуктов для синтеза стероидных лекарственных препаратов.

Стероидные препараты широко применяются в медицинской практике в качестве гормональных, противовоспалительных, антиаллергических, анаболических, контрацептивных, противораковых и других лекарственных средств. Осуществление микробиологическим путем получения 9-альфа-оксиандрост-4-ен-3,17-диона (9-ОН-АД) из стеринов растительного или животного происхождения обеспечивает сырьевую базу для синтеза ряда 9-альфа-галогензамещенных кортикоидов [1]
Деградацию боковой цепи стеринов способны вести многие нокардиоподобные бактерии (Rhodococcus, Nocardia, Corynedacterium, Arthrobacter), однако, наиболее эффективная конверсия стеринов до С-17-кетостероидов (С-19-стероидов) описана для бактерий рода Mycobacterium.

Особенностью стеринов является их низкая растворимость в воде (1 3 мг/л), что осложняет их трансформацию. При осуществлении микробиологических превращений как субстрат, так и продукт большей частью находятся в твердой фазе, при этом скорость растворения субстрата является фактором, лимитирующим большинство процессов конверсии стероидов.

Известны способы получения С-17-кетостероидов путем микробиологической конверсии стеринов с использованием бактерий рода Mycobacterium, предусматривающие внесение субстрата в виде тонкоизмельченного порошка, гомогенного по размерам частиц (псевдокристаллоферментация) [2] или в виде суспензии в воде (так называемое "мокрое" измельчение с неионогенными поверхностно-активными веществами, например, Tween R, Span R, Tegin R, Tagat R, Brij R и т. д.) [3]
Указанные способы имеют целый ряд недостатков (дорогостоящее специальное оборудование, повышенная трудоемкость, низкие нагрузки субстратов), затрудняющих их практическую реализацию, поэтому в настоящее время представляют лишь теоретический интерес.

Известен способ получения С-17-кетостероидов, в частности, смеси андроста-1,4-диен-3,17-диона (АДД) и андрост-4-ен-3,17-диона (АД) путем микробиологической трансформации стеринов с помощью Mycobacterium sp. NRRL 3683B в присутствии альфа-, бета- и гамма-циклодекстрина [4] Максимальный эффект достигается в присутствии гамма-циклодекстрина при его мольном соотношении к субстратам 2:1. При этом суммарный выход АДД и АД составляет 80% от теоретически возможного при сокращении времени трансформации от 180 часов (в контроле) до 120 часов и нагрузке субстратов (холестерина, холестенона и ситостерина) 1 г/л.

Однако, эффективность микробиологической конверсии стеринов при использовании указанного метода ограничена низкими концентрациями субстрата, что, возможно, обусловлено относительно низкой растворимостью комплексов использованных циклодекстринов с субстратом и продуктами реакции. Кроме того, использование гамма-циклодекстрина для крупномасштабных производств неэкономично из-за его высокой стоимости. Использование бета-циклодекстрина является более экономичным, однако, в этом случает наблюдается снижение выхода(суммарный выход АД и АДД составляет 63% от теоретического).

Известен способ получения 9-ОН-АД из стеринов с 3-бета-окси-дельта-5 конфигурацией (смеси ситостерина и ситостанола) в присутствии органических адсорбентов, например, смолы Wofatit EP62 с помощью Mycobacterium vaccae ZIMET 11053 [5] При осуществлении этого способа субстрат вносят в виде гомогенной суспензии, приготовленной мокрым измельчением с детергентами. Способ обеспечивает 60,3%-ный выход 9-ОН-АД (от теоретически возможного) после 72 часов трансформации при исходной концентрации субстрата (смеси ситостерина и ситостанола) 10 г/л. Осуществление этого способа с использованием культуры Mycobacterium sp. 207 ИБФМ РАН обеспечивает 72%-ный выход целевого продукта (от теоретического) при концентрации ситостерина 5 г/л за 72 часа трансформации (количество остаточного ситостерина составляет 10%) [6]
Повышение эффективности процесса трансформации при использовании адсорбентов обусловлено устранение эффекта ингибирования продуктом, что достигается путем селективной сорбции продукта на органических смолах и выведения его тем самым из зоны реакции.

Однако осуществление этого способа требует специального технологического оборудования для предотвращения разрушения адсорбционной смолы в процессе ферментации, что значительно осложняет практическую реализацию и масштабирование процессов.

В литературе описан способ получения 9-ОН-АД, предусматривающий культивирование, осаждение центрифугированием, предобработку биомассы M. fortuitum NRRL B-8119 детергентом (аддуктом полиоксиэтилена полиоксипропилена с диэтилтриамином), отмывку и ресуспендирование биомассы с последующим использованием ее для трансформации ситостерина [7] Субстрат в этом случае используют в виде комплекса с детергентом, полученного либо путем лиофильной сушки смеси их бензольных растворов, либо "мокрым" измельчением смеси с помощью дезинтегратора. Максимальный выход продукта при 10 г/л субстрата (содержащего 55% ситостерина, 39% кампестерина, 5% стигмастерина и 1% насыщенных стеринов) составляет 4,4 г/л (60,2% от теоретически возможного) после 96 часов трансформации при использовании аддукта полиоксиэтилена полиоксипропилена с диэтилтриамином (DETA EOPO6) при 2-х часовой предобработке биомассы.

Недостатком способа является необходимость введения двух дополнительных операций (приготовление комплекса субстрата с детергентом и предобработка биомассы детергентом), что значительно усложняет практическую реализацию и масштабирование процесса.

Наиболее близким к предлагаемому по достигаемому эффекту и технической сущности является способ получения 9-ОН-АД, предусматривающий микробиологическую трансформацию ситостерина с использованием M. fortuitum NRRL B-8119, где для интенсификации процесса трансформации применяют синтетические детергенты сополимеры полиоксиэтилена с полиоксипропиленом, аддукты этих сополимеров с диэтилтриамином и стероидные детергенты [7] Детергенты данном случае выполняют роль комплексообразователей, способствующих солюбилизации субстрата. При этом субстрат используют в виде комплекса с детергентом, полученного либо путем лиофильной сушки их смеси, либо "мокрым" измельчением ее с помощью дезинтегратора. Максимальный выход 9-ОН-АД составлял 45% от теоретического при 10 г/л субстрата, содержащего 99% трансформируемых стеринов 55% ситостерина, 39% кампестерина, 5% стигмастерина и 1% насыщенныхстеринов при использовании полиоксиэтилен-полиоксипропилен сополимеров или их аддуктов с диэтилтриамином.

Однако использование вышеуказанных детергентов часто вызывает нежелательную деградацию стероидного скелета, что может приводить к потерям субстрата, к увеличению числа побочных продуктов и ограничивает выход целевого продукта, делает нецелесообразным использование более высоких нагрузок субстрата. Кроме того, необходимость специальной стадии приготовления комплекса субстрата с детергентом усложняет способ, а малая доступность используемых детергентов затрудняет его практическую реализацию.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в повышении эффективности процесса микробиологической трансформации стеринов до 9-ОН-АД.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения заключается в увеличении нагрузки субстрата, обеспечении высокой степени его превращения, повышении выхода 9-ОН-АД и упрощении способа.

Сущность способа заключается в том, что согласно способу получения 9-ОН-АД путем микробиологической трансформации стеринов бактериями рода Mycobacterium в присутствии комплексообразователей, отличающийся тем, что в качестве комплексообразователей используют водорастворимые химические производные бета-циклодекстрина.

В качестве производных могут быть использованы, например, алкиленгликолевые (этиленгликоль-, пропиленгликоль) или карбоксиалкильные производные бета-циклодекстрина (карбоксиметил- бета-циклодекстрин).

Этиленгликолевое и пропиленгликолевое производное бета-циклодекстрина получают при взаимодействии бета-циклодекстрина с оксидами этилена или пропилена в присутствии КОН [8] Карбоксиметил бета-циклодекстрин получают по известному методу [9]
Эффективность использования циклодекстринов в процессах микробиологической трансформации стероидов, как предполагают, также как и при использовании синтетических детергентов, используемых в способе-прототипе, основана на образовании их комплексов включения с субстpатами и продуктами реакции. Как известно, образование комплексов включения органических соединений с циклодекстринами может сопровождаться изменением агрегатного состояния, химической стабильности, увеличением смачиваемости, снижением токсичности, изменением спектральных характеристик и других характеристик исходного соединения [9]
Введение алкиленгликолевых или карбоксиалкильных заместителей в структуру бета-циклодекстрина приводит к изменению гидрофильных свойств комплекса, к повышению растворимости как самого циклодекстрина, так и, вероятно, его комплексов со стероидами (субстратами и продуктами реакции). Возможно, что введение циклодекстринов в трансформационную среду определяет повышение скорости обменных процессов при осуществлении микробиологической трансформации стеринов до 9-ОН-АД и, соответственно, повышение выхода 9-ОН-АД (до 90 40% от теоретического) при высоких (5 20 г/л) нагрузках субстратов, облегчает анализ и выделение целевых продуктов за счет более легкого разрушения их комплексов с циклодекстринами. Выделение целевого продукта может быть осуществлено известными способами, например, адсорбционной хроматографией сиспользованием полистирольных носителей.

В отличие от синтетических детергентов использование водорастворимых производных циклодекстринов не требует введения специальной стадии для получения из комплексов с субстратами реакции. Кроме того, использованные замещенные циклодекстрины могут быть регенерированы и использованы при дальнейших трансформациях, что делает процесс еще более экономически выгодным.

Предлагаемый способ может быть использован также для получения других С-17-кетостероидов, замещенных в 9-ом положении.

Сведения об использовании циклодекстринов или их производных в процессах микробиологической трансформации стеринов до стероидов 9-ОН-АД в доступной литературе отсутствуют.

Анализ стероидов. Анализ продуктов трансформации проводят методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для этого пробы культуральной жидкости заливают 2 5-кратным объемом этилацетата и проводят экстракцию стероидов. При анализе методом ТСХ аликвоты экстракта (5 20 мкл) наносят на пластинки "Силуфол UV 254" (15 x 15 см) или "Мерк" на расстоянии 15 мм от края. После нанесения пластинки помещают в хроматографическую камеру, содержащую смесь бензол: ацетон (объемное соотношение 3: 1). После прохождения фронта растворителя пластинку вынимают, подсушивают на воздухе. Оценку содержания стероидов проводят путем сравнения хроматографической подвижности (Rf), площади пятна и интенсивности поглощения в ультрахемископе (Desaga) с образцами стандартов.

Для оценки содержания стеринов пластинку с нанесенными образцамипосле прохождения фронта растворителя подсушивают на воздухе, опрыскивают 10%-ным спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты до желто-зеленоватого окрашивания и нагревают до 50 60 С до появления синих пятен.

Оценку содержания стероидов методов ВЭЖХ проводят с использованием установки фирмы ЛКВ (Швеция) и колонки типа Si 100 в системе гексан изопропиловый спирт (85:15) (объемн.) при скорости протока 1 мл/мин; детекция по поглощению при 243 нм.

При использовании технического ситостерина с общим содержанием стеринов 87,5% (содержание чистого ситостерина составляет 66,7%) расчет концентрации субстрата ведут с учетом общего содержания трансформируемых стеринов в техническом.

Выход продукта выражают в процентах от теоретически возможного, исходя из разницы молекулярных весов субстрата и продукта (100%-ный выход продукта из 1 моль субстрата равен 1 Моль, т.е. в весовом выражении, 100% выход, 9-ОН-АД из 415 г химически чистого ситостерина составляет 302 г).

Способ иллюстрируется примерами.

Пример 1. Бактерии Mycobacterium sp. 207 ИБФМ РАН культивируют на среде следующего состава (г/л): глицерин 10; дрожжевой экстракт 10; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,5; аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 1,5; магний сернокислый, 7 водный 0,2; железо сернокислое, 7 водное - 0,002; цинк сернокислый, 7-водный 0,002, дистиллированная вода, в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды, на качалке (220об/мин) при 28 30 С в течение 24 48 часов.

Трансформацию ситостерина проводят на среде следующего состава (г/л): глицерин 5; мочевина 0,125; аммоний сернокислый 3,0; калий фосфорнокислый двузамещенный 1,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 4,0; магний сернокислый 4 0,2; дистиллированная вода, рН 6,5 7,2. Субстрат, полученный мокрым измельчением в дезинтеграторе типа ФУГ (время обработки 15 мин) (7,5 г/л) и этиленгликоль-бета-циклодекстрин вносят перед автоклавированием (0,5 ати; 30 мин). Мольное соотношение циклодекстрин: субстрат составляет 2:1.

Трансформацию проводят в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 25 100 мл среды в аэрируемых условиях (220 об/мин) при 28 30 С. При засеве используют 10% (объемн.) инокулята.

Выход 9-ОН-АД составляет через 96 часов трансформации 80% степень превращения субстрата 90%
Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1, но используют ситостерин без предварительного измельчения дезинтеграцией и трансформацию ситостерина проводят в присутствии карбоксиметилциклодекстрина.

Выход 9-ОН-АД составляет 75% через 168 часов трансформации, степень превращения субстрата 90%
Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, но трансформацию ситостерина осуществляют в присутствии пропиленгликольциклодекстрина.

Выход 9-ОН-АД составляет 70% через 96 часов трансформации, степень превращения 90%
Пример 4. Способ осуществляют по примеру 3, но используютситостерин в концентрации 5 г/л.

Выход 9-ОН-АД составляет 82% через 92 часа трансформации, степень превращения субстрата 97%
Пример 5. Способ осуществляют по примеру 3, но используют ситостерин в концентрации 20 г/л и пропиленгликольциклодекстрин вносят в мольном отношении к ситостерину 1:1.

Выход 9-ОН-АД составляет 41% через 164 часа трансформации, степень превращения субстрата 62%
Пример 6. Способ осуществляют по примеру 3, но в качестве субстрата используют холестерин (5 г/л) (фирмы "Серва", ФРГ, чистота 98%) без предварительного измельчения.

Выход 9-ОН-АД составляет 61% через 72 часа трансформации, степень превращения субстрата 75%
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет повысить эффективность процесса получения 9-ОН-АД за счет повышения выхода целевого продукта при высоких (5 20 г/л) нагрузках субстрата, а также упростить способ трансформации.

Кроме того, способ облегчает выделение и анализ целевых продуктов за счет снижения прочности комплексов циклодекстрина со стероидами по сравнению с прототипом, обеспечивает возможность практической реализации и масштабирования процессов.

Источники информации
1. Kieslich K.J. Basic Microbiol. 1985, 25, 7, 461-474.

2. Kurakov V. V. ryizhkova V.M. Korobova Yu.N. Skvortsova L.F. Conf. Proc. F. E. C. S. 5th Int.Conf. on Chem. Biotechnol. of Biol. Active. Nat. Prod. 1989, Varna, Bulgaria, Biotechnol. v.4, 486-493.

3. Smith R. Accosta D. Rosazza J.P. In: Ghose T.K. Fischer A. Blakebrough N. (Edts.), Adv. in Biochem. Eng. 1977, Springer, Berlin, Heidelberg, 5, 69-100.

4. Hesselink P. G. M. Van-Vliet S. De Vries H. Witholt B. Enz. Microb. Technol. 1989, 11, 7, 398-404.

5. Патент ГДР N 291341, кл. C 12 P 33/16, 1991.

6. Борман Е.А. Редикульцев Ю.В. Кощеенко К.А. Турута А.М. Камерницкий А. В. Прикл. биохим. микробиииииол. 1992, 28, 4,551-556.

7. Atrat P.G. Koch B. Szekalla B. Horhold-Shubert C. J.Basic Microbiol. 1992, 32, 3, 147-157 (прототип).

8. Патент США N 3459731, кл. 26-209, 1969.

9. Szejtly J. In: Cyclodexxtrins and their Inclusion Cyclodextrins Complexes, Acadeemiai Kiado, Budapest, 1982, 27.

Использование: биотехнология, медицинская промышленность. Сущность изобретения: 9-альфа-оксиандрост-4-ен-3,17-дион (9-альфа-окси-АД) получают путем трансформации стеринов например, ситостерина, холестерина, и др. бактериями рода Mycobacterium в присутствии водорастворимых химических производных бета-циклодекстрина, например, алкиленгликолевых (этиленгликоль-, пропиленгликоль-) или карбоксиалкильных (карбоксиметил-)-бета-циклодекстрина. Способ позволяет повысить эффективность процесса получения 9-альфа-окси-АД, повысить выход 9-альфа-окси-АД при высоких 5-20 г/л) нагрузках субстратов, а также упростить процесс. Кроме того, способ облегчает выделение и анализ целевого продукта за счет снижения прочности комплексов циклодекстрина со стероидом по сравнению с известными комплексообразователями, обеспечивает возможность практической реализации и масштабирования процессов.

1 Способ получения 9-альфа-оксиандрост-4- ен-3,17-диона путем микробиологической трансформации стеринов бактериями рода Mycobacterium в присутствии комплексообразователей, отличающийся тем, что в качестве комплексообразователей используют водорастворимые химические производные бета-циклодекстрина.