СПОСОБ ИНГИБИЦИИ ВИРУСА ГРИППА СЕРОТИПОВ А И В Российский патент 1995 года по МПК A61K35/56 

Изобретение относится к вирусологии, в частности, к поиску способов ингибирования вирусов гриппа.

Известны способы ингибирования вирусов гриппа с помощью химиопрепаратов, однако арсенал их невелик и ограничен рядом препаратов, которые в основном находятся на стадии клинического испытания. К ним относятся виразол, дейтифорин, арбидол. Все они химически синтезированные вещества, первый из них разработан и выпускается в США, обладает средней токсичностью и способен кумулироваться в организме. Два других препарата воздействуют только на вирусы гриппа серотипа А. Все выше перечисленные химиопрепараты апробированы при пероральном применении.

В нашей стране для лечения гриппа используется ремантадин химически синтезированный препарат, производство которого налажено лишь в объединении "Латвбиофарм", что затрудняет его широкое использование. Кроме того, ремантадин обладает побочным действием, имеется ряд противопоказаний для применения, а также не эффективен в отношении вируса гриппа В.

Вместе с тем потребность в антивирусных препаратах очень велика, что следует из анализа заболеваемости гриппом и другими острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ) по стране и отдельным городам. Так, согласно данным приказа МЗ СССР N 327 от 07.08.90 г в стране за один год регистрируется 70 млн случаев заболеваний гриппом и ОРВИ. Сумма выплаты по листкам нетрудоспособности составляла ежегодно более 3,5 млрд рублей. Истинное же число этих заболеваний в полтора раза больше, поскольку, как показало специальное эпидемиологическое наблюдение, половина из числа взрослых больных гриппом и ОРВИ не обращаются за врачебной помощью, но используют различные медикаменты.

Исследуемый препарат мидийный гидролизат из мяса морских моллюсков мидий сем. Мytilidae. МИГИ-К представляет собой темно-коричневую жидкость, в состав которой входят аминокислоты (в том числе все незаменимые), низкомолекулярные пептиды, полиеновые жирные кислоты, фосфатиды, гуминовые кислоты, меланоидины и значительное количество микроэлементов в формах, легко усваиваемых человеком. На МИГИ-К имеются отраслевые стандарты как на пищевой продукт ТУ-15-1036-89 (Гидролизат из мидий пищевой (4) и ТУ-15-1089-90 (5) гидролизат из мидий пищевой для лечебно-профилактического применения), который используется в качестве пищевой добавки для лиц, ослабленных хроническими заболеваниями.

Проведенные исследования по апробации мидийного гидролизата (МИГИ-К) в качестве ингибитора вирусов гриппа выявили его высокие антивирусные потенции при энтеральном введении. Исследуемый препарат в разведении 1:50-1:100 обладал более высоким антитоксическим действием по сравнению с аналогами и прототипом при разных методах для аппликации (интраназальном, пероральном). Выживаемость мышей при введении МИГИ-К увеличивалась в 4-8 раз по сравнению с контролем. Препарат воздействовал на вирусы гриппа всех циркулирующих в настоящее время сероподтипов: А(Н1N1), А(Н3N2) и В, его вируснейтрализующая активность in vitro достигала 4,0-6,25 lg ЭИД₅₀. Сырьем для производства предлагаемого ингибитора вирусов является естественный биологический субстрат в отличии от известных химически синтезированных аналогов.

Для выявления антивирусного эффекта МИГИ-К в опытах используют реакцию нейтрализации вируса гриппа с последующим заражением куриных эмбрионов.

П р и м е р 1. Вирус гриппа А (Миссисипи) 1/85 (Н3N2) разводят забуференным физиологическим раствором от 10^-1 до 10^-8. К 1 мл каждого разведения вируса добавляют 1 мл неразведенного МИГИ-К (опытные ряды), параллельно в пробирках соединяют равные объемы вируса гриппа в разведениях от 10^-1 до 10^-8 с забуференным физиологическим раствором (контрольные ряды). Смесь в пробирках выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего вводят по 0,2 мл шприцом в аллантоисную полость 10-11 дневных куриных эмбрионов (по 4 эмбриона на каждый образец). После 48 ч инкубации при +37^оС эмбрионы охлаждают при +4^оС, вскрывают, собирают аллантоисную жидкость и констатируют наличие вируса в РГА с 1% куриными эритроцитами. Титр вируса гриппа в опытном ряду (с МИГИ-К) составляет 3,5 lg ЭИД₅₀, в контрольном ряду (с физиологическим раствором) 7,5 lg ЭИД₅₀, т.е. предлагаемый препарат снижает инфекционный титр вируса на 4 lg ЭИД₅₀ (в 10000 раз).

П р и м е р 2. Вирус гриппа Nib-25 А(Н3N2) разводят забуференным физиологическим раствором от 10^-1 до 10^-8. К 1 мл каждого разведения вируса добавляют 1 мл неразведенного МИГИ-К, все последующие процедуры проводят как в примере 1. Титр вируса в контрольном ряду составляет 6,25 lg ЭИД₅₀, в опытном ряду вирус не обнаружен, т.е. МИГИ-К полностью нейтрализует вирус гриппа, т.е. снижает титр вируса более чем на 6,25 lg ЭИД₅₀.

П р и м е р 3. Вирус гриппа А (Виктория) 1 (88(Н1N1) разводят забуференным физиологическим раствором от 10^-1 до 10^-8. Все последующие процедуры проводят как в примере 1 за исключением условий инкубации зараженных куриных эмбрионов. Эмбрионы выдерживают 72 ч при температуре +34^оС. Инкубационный титр вируса в присутствии предлагаемого препарата составляет 1,75 lg ЭИД₅₀, без препарата 6,5 lg ЭИД₅₀. Снижение инфекционного титра вируса в присутствии МИГИ-К составляет 4,75 lg ЭИД₅₀.

П р и м е р 4. Вирус гриппа В (Виктория) 2/87 разводят физиологическим раствором от 10^-1 до 10^-7. К 1 мл каждого разведения вируса добавляют 1 мл неразведенного МИГИ-К, последующие процедуры как в примере 3.

Инфекционный титр вируса без добавления препарата составляет 2,75 lg ЭИД₅₀, в присутствии МИГИ-К вирус не обнаружен. Снижение инфекционного титра вируса в опыте с использованием предлагаемого препарата 2,75 lg ЭИД₅₀.

Для определения антивирусного действия МИГИ-К in vivo использовали белых мышей, зараженных интраназально токсигенным (бьющим) вариантом вируса гриппа.

П р и м е р 5. МИГИ-К разводят забуференным физиологическим раствором в соотношении 1: 50 и вводят в объеме 0,1 мл интраназально под легким эфирным наркозом белым беспородным мышам весом 14-16 г. Через 5 ч этим же животным вводят в объеме 1 мл интраназально под легким эфирным наркозом токсигенный (бьющий) вариант вируса гриппа А (Виктория) 72 (Н3N2). Контрольной группе животных за 5 часов до заражения токсигенным вирусом вводят интраназально по 0,1 мл забуференного физиологического раствора. В течение 7 суток наблюдают за животными, регистрируя их гибель. В группе животных, получивших МИГИ-К, выжило 15 мышей из 20 (75%±9,9), в контрольной группе (без предлагаемого препарата) выжило 3 из 33 (9,1±5,0), т.е. выживаемость мышей при введении МИГИ-К интраназально повышается в 8,2 раза, различия статистически достоверны (р<0,001) (7).

П р и м е р 6. МИГИ-К в разведении 1:100 и 1:200 в объеме 0,1 мл вводят интраназально белым беспородным мышам. Дальнейшие процедуры как в примере 5. В группе животных, получивших предлагаемый препарат в разведении 1:100, выживает 68% ±11,0 мышей, в разведении 1:200-27%±9,7, в контроле без препарата 9,1% ±5,0 (табл. 1), т.е. выживаемость животных при введении в нос МИГИ-К в разведении 1: 100 увеличивается в 7,4 раза (р<0,001), с разведенным 1:200 МИГИ-К в 3 раза (р>0,001).

П р и м е р 7. МИГИ-К разводят забуференным физиологическим раствором в соответствии 1: 10 и вводят интраназально в объеме 0,1 мл. Через 5 ч мышам вводят токсигенный вариант вируса гриппа и все дальнейшие процедуры проводят как в примере 5 и 6. В группе мышей, получивших МИГИ-К, выжило 55,0% (±12,0) животных, в контрольной группе (без препарата) 27,0% (±9,1). Различия в группах статистически не достоверны (р>0,001), т.е. МИГИ-К при разведении 1:10 не обладает антитоксическим действием.

П р и м е р 8. МИГИ-К в разведении 1:50 в объеме 0,5 мл вводят перорально с помощью зонда белым беспородным мышам весом 14-16 г. Через 5 ч этим же животным вводят в объеме 0,1 мл интраназально под легким эфирным наркозом токсигенный вариант вируса гриппа А (Виктория) 72 (Н3N2). Контрольный группе животных за 5 ч до заражения токсигенным вирусом вводят орально с помощью зонда по 0,5 мл забуференного физиологического раствора. В течение 7 суток наблюдают за гибелью животных.

В группе животных, получивших МИГИ-К орально, выжило 12 мышей из 18 (66% ±11,0), в контрольной группе (без предлагаемого препарата) выжило 3 из 33 (9,1% ±5,0), т. е. выживаемость мышей при приеме МИГИ-К увеличивается в 7,2 раза, различия статистически достоверны (р<0,001).

П р и м е р 9. МИГИ-К в разведении 1:100 и 1:200 в объеме 0,5 мл вводят орально с помощью зонда белым беспородным мышам весом 14-16 г. Последующие манипуляции как в примере 6. В группе животных, получивших МИГИ-К в разведении 1:100, выживает 36%±10,0 мышей, в разведении 1:200-18%±8,4, в контроле 9,1% ±5,0 (табл.2), т.е. выживаемость животных с введенным орально МИГИ-К в разведении 1:100 увеличивается в 4 раза (р<0,05), с разведенным 1:200 препаратом в 2 раза (статистически не достоверно р>0,001).

П р и м е р 10. МИГИ-К разводят забуференным физиологическим раствором 1:10 и вводят в объеме 0,5 мл перорально. Через 5 ч мышам вводят токсигенный вариант вируса гриппа и все дальнейшие процедуры как в примерах 5 и 6. В группе мышей, получивших МИГИ-К перорально, выжило 40,0% (±11,0), в контрольной группе 27,0% (±9,1%). Различия в группах статистически не достоверны (р>0,001), т. е. исследуемый препарат в разведении 1:10 не обладает антитоксическим действием.

Представленные данные в опытах in vivo свидетельствуют о том, что положительные результаты получены при использовании МИГИ-К интраназально или перорально в диапазоне разведений от 1:50 до 1:100.

Приведенные примеры доказывают выраженную противовирусную активность предлагаемого препарата мидийного гидролизата (МИГИ-К) в отношении вирусов гриппа серотипов А и В.

В табл.3 обобщены результаты, полученные при экспериментальном изучении МИГИ-К и его прототипа-ремантадина в опытах in vitro и in vivo на модели вируса гриппа.

Данные свидетельствуют о явном преимуществе предлагаемого препарата перед прототипом по ряду показателей: большей широтой антивирусного воздействия на вирусы гриппа обоих серотипов А и В, повышенной антивирусной активностью in vitro (4,0-6,25 lg ЭИД₅₀ против 2,0-3,0 lg ЭИД₅₀ у ремантадина), более высоким антитоксическим действием in vivo (выживаемость животных при введении предлагаемого препарата увеличивается в 4-8 раз, при использовании ремантадина в 2-3 раза), наличием антивирусного эффекта МИГИ-К in vivo не только при его оральном применении, но и при введении в нос входные ворота гриппозной инфекции, получением препарата из естественного биологического субстрата (мяса мидий) и разрешенного в качестве пищевой добавки для лечебно-профилактического применения, тогда как ремантадин и другие препараты являются химически синтезированными и обладают рядом побочных воздействий на организм.

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для ингибиции вирусов гриппа серотипов А и В. Изобретение заключается в том, что в качестве ингибитора используют мидийный гидролизат из мяса морских моллюсков
мидий семейства Mytilidae. Средство обладает повышенной антивирусной активностью и высоким антитоксическим действием. 3 табл.

СПОСОБ ИНГИБИЦИИ ВИРУСА ГРИППА СЕРОТИПОВ А И В путем введения ингибитора, отличающийся тем, что в качестве ингибитора используют мидийный гидролизат из мяса морских моллюсков мидий семейства Mytilidae, который вводят перорально в дозе 0,25 0,5 мл/кг или интраназльно в дозе 0,05 0,1 мл/кг.