Способ получения инактивированной гриппозной вакцины Советский патент 1993 года по МПК A61K39/145 

fe

Использование: в медицинской промышленности и касается производства вирусных препаратов. Сущность изобретения: для заражения каждого куриного эмбриона используют смесь вирусов гриппа, содержащую по 0,1 мл обоих штаммов с инфекционной активностью 3,0-3,5 Ig ЭИДю 0,2 мл при равном титре гемагглютининов не ниже 1:512. 4 табл.

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства вирусных вакцин, в частности инактивиро- ванной гриппозной вакцины.

Целью изобретения является получение двукратной экономии основного биологического сырья (куриных эмбрионов) и трудозатрат, связанных с его обработкой (в частности технологические операции по транспортировке, заражению, 72-часовой инкубации при +34°С. охлаждению, сбору вируссодержащей жидкости, очистке от посторонних примесей, концентрированию вирусной суспензии, инактивации вируса, сохранению полуфабриката, утилизации отработанного сырья) при производстве инак- тивированной гриппозной вакцины.

Поставленная цель достигается тем, что вдвое меньше по сравнению с ранее требовавшимся количеством 10-дневных куриных эмбрионов заражают смесь двух вакцинных высокорепродуктивных штаммов, взятых в дозе 3,0-3,5 Ig ЭИДзо/0,2 мл при равном титре гемагглютининов не ниже 1:512: используют вакцинные штаммы не зависимо от их происхождения - родительский вирусов, применявшихся для их получения (см. примеры 1 и 2). После 72 ч инкубации при 34°С в течение 12-24 ч отбирают вируссо- держащуюаллантоисиую жидкость. Последнюю подвергают очистке от посторонних примесей, концентрированию и инактивации. В полученную вирусную суспензию до- бавляют стабилизатор и фасуют в стеклянные флаконы различной емкости или ампулы.

Заявленное предложение, суть которого заключается в получ ении двойного уро00

ю ю VI

Ч

жая вакцинных штаммов, на одной партии куриных эмбрионов позволяет экономить не только половину ценного питательного продукта, каковыми являются куриные яйца, но и сократить на половину трудозатраты, связанные с их переработкой по всему технологическому циклу при сохранении ге- магглютинирующей, иммуногенной активности и чистоты конечного продукта (вакцины).

Пример 1. Проводят совместное культивирование на куриных эмбрионах двух вакцинных штаммов вируса гриппа А/Тайвань/1/86(Н1М1) (донор репродуктивное™ А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирусА/Тайвань/1/86)и А/Миссисипи/85(НЗМ2) (донор репродук- тивности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Миссисипи/1/85), взятых в равных объемах и дозах, соответствующих 3,5 Ig ЭИДэд. Инкубируют при 34°С в течение 72 ч. Зараженные куриные эмбрионы охлаждают при +4°С в течение 12-24 ч. вскрывают и собирают емруссодержащую аллантоисную жидкость с гемагглютинирующей активностью 1:512/0,2 мл.

Концентрирование и очистку вируссо- держащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) от посторонних примесей осуществляют следующим образом: ВАЖ фильтруют на модуле ФТ (НПО АН СССР) через два слоя картонного фильтра (ТУ 13-7303001-686-84) и через 1 слой полимерного фильтра МФА- МА (Владипор) с диаметром пор 0,8 мкм при давлении 1,2 атм. Контроль фильтрованной ВАЖ проводят в реакции торможения ге- магглютинации (РГА) с 1 %-ной суспензией куриных эритроцитов. Концентрирование ВАЖ проводят на ультрафильтрационной установке УПЛ-06 на полых волокнах ВПУ- 15 ПА.

Гельфильтрационную очистку концентрата ВАЖ проводят на силикатном сорбенте - макропористом стекле МПС (2000 В Горьковского опытного завода при ВНИИ НП), модифицированном поливинилпирро- лидоном в колонке 5 х 80 см. Элюцию проводят 0,02 М фосфатным буферным раствором (ФБР) рН-7.2-7.4+0,15 М NaCI. После прохождения через сорбент собирают фракции по 20 мл, определяют в них гемагглютинирующую активность, содержание белка и овальбумина. Объединенный вирусный материал инактивируют УФ-лумами в течение 3 мин в статистических условиях и проверяют полноту инактивации путем заражения куриных эмбрионов (2 пассажа). Гемагглютинирующую активность определяют в реакции гемагглютинации с 1 %- ными куриными эритроцитами. Содержание

белка определяют по методу Лоури с предварительным осаждением белка 20%-ной трихлоруксусной кислотой. Содержание овальбумина определяют в реакции непрямой гемагглютинации с комерческим препаратом. Определение количественного содержания гемагглютинина в препарате осуществляют методом радиальной иммун- диффузии (РИД) по Schild y (4).

0 Безвредность препарата оценивают на белых беспородных мышах и морских свинках в соответствии с приказом МЗ СССР № 31 от 13.01.83 г. Иммуногенную активность проверяют на беспородных мышах весом

5 14-16 г. Животным вводят внутрибрюшинно однократно и двукратно с интервалом в 14 дн по 0,3 и 0,6 мл препарата. Кровь берут на 10-14 сут после последней иммунизации, сыворотки проверяют в реакции торможе0 ния немагглютинации (РТГА) с гомологичным штаммом вируса гриппа. Данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют о достаточно высокой иммуногенности полученного препарата как в отношении штам5 ма гриппа А/Тайвань/1/86 (H1N1), так и А/Миссисипи/ 1/85(H3N2), как при однократном, так и при двукратном введении.

Далее полученный вакцинный препарат испытывают в опыте перекрестной за0 щиты иммунных животных по методу (5). С этой целью готовят иммунную группу животных; белых мышей весом 12-14 г иммунизируют дивакциной внутрибрюшинно в объеме 0,3 мл однократно и двукратно с

5 интервалом в 21 день. Через 21 день после последней иммунизации мышей делят на 4 группы, 2 из которых иммунизированы однократно и 2 иммунизированы двукратно, и заражают интранаэально под легким эфир0 ным наркозом свежими аллантоисными культурами гомологичных штаммов вируса гриппа: А/Тайвань/ 1/86(H1N1) и А/Миссисипи/1/85(H3N2). Кроме иммунных животных используют две контрольные группы

5 мышей, предварительно не иммунизированных. Вирусы используют в разведениях от 101 до 10 , применяя по 4 мыши на каждое разведение вируса. Через 72 ч после заражения мышей обескровливают путем

0 забора крови из венозного синуса у медиального угла глаза, вскрывают, извлекают легкие, растирают в ступке с песком и готовят легочную суспензию. Суспензией легких каждой мыши заражают по 4 эмбриона, ин5 кубируют 72 ч при Т°-34°С. После охлаждения эмбрионов в течение 12-24 ч при +4° их вскрывают и регистрируют репродукцию вируса с помощью реакции гемагглютинации. Степень защиты оценивают по разнице репродукции вирусов контрольных и опытных групп, используя расчет по Керберу (6). Данные эксперимента, представленные в табл. 2, свидетельствуют о высокой степени защищенности мышей, иммунизированных как однократно, так и двукратно. В отноше- нии штаммов вируса гриппа А/Тайвань/ 1 /86(Н 1N 1) защита составила соответственно 3,75 Ig ИДбо и 5,25 Ig ИДво, А/Миссисипи/1 /85{H3N2) - 3,75 Ig ИДы.

Таким образом, при совместном культивировании двух штаммов вируса гриппа: А/Тайвань/1/86(Н1М1) и А/Миссиси- пи/1/85(НЗМ2), получают вакцинный препарат, соответствующий требованиям ТУ 42.14,149-78. Параметры полученного препарата в сравнении с прототипом представлены в табл. 4.

Пример 2. Проводят совместное культивирование на куриных эмбрионах двух вакцинных штаммов вируса гриппа: А/Тайвань/1 /86(h1 N1)(донор репродуктив- ности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Тайвань/1/86) и Р - 1 (H3N2) (донор ре- продуктивности А/Ленинград/9/46 х дикий вирус А/Ленинград/16/88), взятых в равных объемах и дозах, соответствующих 3 Ig ЭИД50- Инкубируют при Т° - 34°С в течение 72 ч. Затем зараженные куриные эмбрионы охлаждают при Т° + 4°С в течение 12-24 ч, вскрывают, собирают вируссодержащую аллантоисную жидкость с гемагглютиниру- ющей активностью 1:512. Далее проводят очистку, концентрирование, элюцию по методу, описанному а примере 1. Определение общего белка, овальбумина и весового количества гемагглютинина проводят аналогично описанному в примере 1 результаты по иммуногенной активности свидетельствуют от ее достаточности (средняя геометрическал титров антител в отношении штамма вируса гриппа А/Тайвэнь/1/86(H1N1) при однократной иммунизации составила 1:147, а в отношении штамма вируса гриппа P-1(H3N2) составила 1:169, при двукратной иммунизации - 1:447 по отношению к обоим штаммам вируса гриппа). Далее проводят испытания препарата в опыте перекрестной защиты иммунных животных, Орэнжировка опыта аналогична описанной в примере 1.

Результаты опыта представлены в табл. 3 и свидетельствуют о высокой степени защищенности мышей в отношении гомологичных штаммов вируса гриппа. Так, степень защиты к вирусу гриппа А/Тай- вань/1/86(Н1М1) при однократной и двукратной иммунизации составила соответственно 3.0 и 5,0 Ig ИДю. а к вирусу Р-1 (H3N2) - 1.75 и 2,75 Ig ИД.

Как и в примере 1, полученная дипзкци- на (табл. 4) отвечала требованиям технической документации, но для ее приготовления было истрачено вдвое мень- 5 ше эмбрионов, чем при раздельном культивировании вирусов.

Пример 3. Проводят совместное культивирование на куриных эмбрионах двух вакцинных штаммов вируса гриппа:

0 А/Тайвань/1/86(Н1М1) (донор репродук- тивности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Тайвань/1/86)иР-1 (H3N2) (донор репро- дуктивности А/Ленинград/9/46 х дикий вирус А/Ленинград/16/88), взятых в равных

5 объемах и дозах, соответствующих 2,0 Ig ЭИД50 и 4,0 Ig ЭИД50 с гемагглютинирую- щим титром 1:512. Весь дальнейший процесс: инкубация, сбора вируссодержащей аллантоисной жидкости, технологии, прово0 дили по методу, описанному в примере 1. Полученный вакцинный препарат по гемаг- глютинирующей активности отвечал требованиям,предъявленнымк инактивированным гриппозным вакцинам

5 ИГВ), гемагглютинирующий титр равнялся 1:1024 а 0,2 мл. При определении весового количества немагглютинина в РИД с моноспецифическими сыворотками к штаммам Bnpycfj гриппа А(Н iN ) л A(H3N2) выявлено

0 наличие гемагглю1ик жа A(H3N2) в количестве 30 мк/мл, гемагглютинина A(H1N1) не обнаружено, Была констатирована иммуно- геннил активность мышах к вирусу гриппа A(H3N2)- 1:1ГА а к вирусу А(Н1М1)

5 находились на уропие ингибиторов.

Таким образом, при совместном культивировании /jHy. штаммов гриппа A(H1N1) и A(H3N2), различающихся между собой по инфещ| онной активности в 2 Ig ЭИДьо. не

0 приводи к адекватному илклонению био- мас.сн обоих п таммов вируса гриппа, т.е. страдает репродукция вируса, взятого в до- . зе, мет шей 3 Ig ЭИДда.

Пример 4. Проводят совместное культирироиани двух вакцинных штаммов

5 вируса гриппа А/Тайвань/ 1/86(H1N1) (донор продуктивности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Тайвань/1 /86) и А/Миссисипи/1/85(H3N2) (донор репродуктивности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Мис0 сисипи/1/85), взятых в равных объемах и дозах, соответствующих 3 Ig ЭИД50, и с равными исходными гемагглютинирующими титрами: А/Тайвэнь/1/86(Н1М) - 1/512, А/Миссисипи/1/85/(НЗЫ2) - 1/128. Пол5 ученный вакцинный препарат по гемагглю- тинирующей активности отвечает требованиям, предъявленным к ИГВ - 1:1024 в 0.2 мл.

При определении весового количества гемагглютинина в РИД выявлено: концентраций гемагглютинина A(H1N1) равнялась 26 мкг/мл, что соответствует требованиям, а к гемагглютинину A(H3N2) - 510 мкг/мл. что не соответствует требованиям, предъявленным к вакцинным препаратам по этому параметру. Иммуногенная активность по отношению к штамму вируса гриппа A(H1N1) составила 1/80. а к /V(H3N2) - 1/40, что не соответствует требованиям к препарату по этому параметру (необходимой 1 /80).

Таким образом, совместное культивирование двух штаммов вируса гриппа А(Н1М1) и A(H3N2). различающихся по ге- магглютинирующей активности, приводит к неравномерному накоплению компонентов, что отрицательно сказывается на качестве препарата.

Учитывая вышеизложенное, оптимальным является совместное культивирование двух штаммов вируса гриппа с инъекционной активностью 3,0-3,5 Ig ЭИДю и при ге- магглютинирующем титре не ниже 1/512.

иммуногенность дивакцины, приготовленной иа сырья, полученного при совместном культивировании двух втаммов вируса гриппа: А (Тайвань) 1/86 (HIH1) Л(Ниссисипи)1/85(НЗК2)

Т а б г. ица2

Результаты опытов аациты мывлй, иинуниаироеанИых дивакциной, состоящей из иганиов Вируса гриппа: А(Тайвань)t/8$(H1N1) I А(Ниссисипи)1/85(НЗК2)

Таким образом, при совместном культивировании двух вакцинных штаммов вируса гриппа A(H1N1) и A(H3N2), взятых в равных объемах и дозах, соответствующих 3,0-3.5 Ig

ЭИДю. при равном титре гемагглютинина не ниже 1:512, имела место двукратная экономия куриных эмбрионов, а также значительное упрощение и сокращение сроков технологического процесса. Это заключалось в следующем: в два раза сокращались объемы сырья, необходимого для очистки и концентрации вируса, уменьшились затраты на транспортировку, хранение, утилизацию отходов и другое.

Формула изобретения

Способ получения инактивированной гриппозной вакцины, включающий накопление вирусной биомассы путем инокуляции куриных эмбрионов штаммами вируса гриппа, отличающийся тем, что используют для заражения каждого куриного эмбриона смесь суспензии двух штаммов вирусов одновременно, содержащую по 0,1 мл каждого с инфекционной активностью 3,0-3.5 1$

ЭИД50/0.2 мл при равном титре гемагглюти- ниновне ниже 1:512.

Т 1 6 л и ц а I

Результаты опыта защиты мышей, имиуниэированных дивакциной, состоявши из таимое «ирусв гриппа: А(Тайввиь)1/В6(И1К|) Р-1 А(Ленинголд) 16/88) (H3NZ)

Результаты контроля исходного алллнтоисного сырья и иелевого продукта сравнении с прототипом

Таблица 3

Таблица)