СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНОГО ГРИППА ПТИЦ Российский патент 2006 года по МПК A61K36/185 A61P31/12 

Область техники

Изобретение относится к области ветеринарии, более конкретно к отысканию средств для профилактики и лечения гриппа птиц

Уровень техники

Вирусы гриппа (ВГ) типа А инфицируют различные виды птиц и млекопитающих, включая людей, лошадей, свиней, китов, тюленей и т.д. Они характеризуются высокой антигенной гетерогенностью поверхностных белков гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) и представлены согласно номенклатуре 15 подтипами НА и 9 NA. Естественными хозяевами вирусов гриппа А являются птицы водного и околоводного комплексов. От птиц изолированы вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков. Несмотря на антигенную гетерогенность вирусов гриппа, только четыре подтипа НА: Н1-Н3 и Н5 и два NA (N1-N2) циркулировали среди людей. Вспышка гриппа среди людей в Гонконге в 1997, вызванная птичьим вирусом гриппа A/H5N1, показала впервые, что преодоление межвидового барьера птица-человек может происходить в естественных условиях. Это был первый случай прямой передачи вируса от птиц человеку. Из 18 госпитализированых больных 6 умерли, не выявлена передача вируса от человека к человеку. В 2003-2004 г. количество инфицированных в разных странах Юго-Восточной Азии возросло до 53, причем 43 человека скончалось. Ситуация осложняется возможностью формирования нового патогенного реассортанта между вирусами гриппа птиц (кур в данном случае) и эпидемическими вирусами гриппа человека.

В настоящее время не известны средства специфической профилактики и лечения вирусного гриппа птиц.

Сущность изобретения

Отсутствие средств специфической профилактики, т.е. невозможность приготовления вакцины традиционным способом на куриных эмбрионах в связи с патогенностью вируса А/H5N1 для кур и куриных эмбрионов, делают актуальной задачу поиска веществ, обладающих активностью в отношении вирусов гриппа А. Авторами настоящего изобретения была установлена противовирусная активность экстракта бересты (белой части коры березы) в отношении вирусов гриппа птиц.

Раскрытие изобретения

Изучение противовирусной активности экстракта бересты в опытах in vitro и in vivo осуществлялось с использованием производимого Обществом с ограниченной ответственностью «Березовый мир» (Россия, г. Москва) «Бересты экстракта сухого» (БЭС) и применяемого в качестве сырья при производстве биологически активных добавок.

I. Исследования in vitro

1.1. Материалы и методы

Вирусы культивировали в аллантоисной полости 10-дневных куриных эмбрионов (КЭ). Инфекционную и гемагглютинирующую активности определяли согласно методам, рекомендованным Всемирной организацией здравоохранения.

Цитотоксическое действие. Клетки МДСК культивировали в 96- и 24-луночных панелях фирмы "Costar" в среде MEM с добавлением 10% фетальной сыворотки телят (Gibco), 10 мМ глутамина и антибиотиков.

Монослой клеток МДСК культивировали в присутствии препарата БЭС, добавленного в ростовую среду MEM в концентрациях от 1 до 500 мкг/мл в течение 48-72 часов при 37°С. Затем клетки 2 раза промывали фосфатным буфером (PBS), окрашивали добавлением раствора нейтральрота в концентрации 33 мг/мл. После инкубирования в течение 3 часов при 37°С раствор удаляли и нейтральрот экстрагировали из живых окрашенных клеток 50% спиртовым раствором Na₂PO₄. Оптическую плотность определяли при длине волны 525 нм. Концентрацию препарата, ингибирующую значение ОП на 50% по сравнению с клеточным контролем, принимали за 50% цитотоксическую дозу (ЦД₅₀).

Противовирусную активность исследуемых препаратов в отношении ВГ А/Н5 учитывали по снижению инфекционного титра вируса в культуре клеток МДСК и снижению уровня подавления оптической плотности (ОП₄₅₀) в тест-системе на основе иммуноферментного анализа (ИФА) в многоцикловых опытах.

Перед заражением вирусом клетки МДСК 2 раза промывали средой без сыворотки для снижения возможной неспецифической реакции. Затем добавляли препараты в исследуемой концентрации в 100 мкл среды MEM и инкубировали с клетками в течение 1,5 часов. Инфицирование проводили 10-кратными разведениями вирусов на среде MEM с добавлением трипсина (ТРСК treated, Sigma) в концентрации 2 мкг/мл. Адсорбцию вируса проводили в течение 40 мин при 37°С. Несорбировавшийся вирус удаляли 3-кратной промывкой средой без сыворотки. К клеточному монослою добавляли различные концентрации исследуемых препаратов в среде MEM с трипсином в концентрации 2 мкг/мл. Контроли вирусов и клеток культивировали в этой же среде. Далее планшеты инкубировали в термостате с CO₂ в течение 72 часов при 37°С. Учет результатов проводили через 72 часа.

При изучении активности противовирусных препаратов методом ИФА клетки МДСК выращивали в 96-луночных планшетах. Перед заражением вирусом клетки МДСК 2 раза промывали средой без сыворотки для снижения возможной неспецифической реакции. Исследуемые препараты добавляли к клеткам в двукратной концентрации в 100 мкл среды MEM. К вирусному контролю добавляли по 100 мкл среды, а к контролю клеток - 200. После инкубации клеток с исследуемыми препаратами в течение 1,5-2 часов при 37°С в лунки, исключая клеточный контроль, добавляли по 100 мкл вируса на среде MEM. Множественность заражения составляла 0,1-0,01 ТЦИД₅₀ на клетку. Все процедуры проводили на среде MEM с добавлением трипсина (ТРСК treated, Sigma) в концентрации 2 мкг/мл. Далее планшеты инкубировали в термостате с CO₂ в течение 20 часов при 37°С. После инкубации клетки исследовали под инвертированном микроскопом, чтобы зарегистрировать отсутствие в них цитотоксических и цитопатических изменений. Среду удаляли и клетки фиксировали 80% ацетоном в PBS в течение 15 минут, хорошо высушивали и затем отмывали 3 раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ, PBS с 0,05% TWEEN 20). Эти и все дальнейшие процедуры отмывки проводили указанным раствором. Затем к клеткам добавляли по 100 мкл раствора PBS с 1% фетальной сыворотки и 0,05% TWEEN 20, инкубировали при 37°С в течение 30 мин. После удаления раствора к клеткам добавляли по 100 мкл моноклональных антител (МКА) к NP-белку вируса гриппа А в концентрации 10 мкг/мл. После инкубации с антителами в течение 1 часа при 37°С в лунки вносили по 100 мкл IgG кролика против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена в разведении 1:1000. После 4-кратной отмывки лигированную пероксидазу выявляли добавлением в лунки 100 мкл ТМБ (33'55' Тетраметилбензидин - субстратный буфер). Реакцию учитывали по оптической плотности при 450 нм в спектрофотометре фирмы «Биоком». Каждое разведение вируса исследовали в 4-х повторах, для которых вычисляли среднее значение ОП-450. Процент ингибирования определяли как отношение ОП-450 опыта / ОП-450 вирусного контроля, умноженное на 100%.

1.2. Цитотоксическое действие препаратов

При изучении токсического действия БЭС в культуре клеток МДСК получены следующие результаты. При визуальной оценке состояния контрольных неинфицированных клеток, культивируемых с испытуемым препаратом в течение 72 часов, удалось установить, что 50% цитотоксическая доза для стандартного коммерческого препарата ремантадина составляет 60 мкг/мл, для БЭС также 60 мкг/мл.

Результаты изучения цитотоксического действия препаратов по окраске клеток нейтральротом показали, что ремантадин и БЭС в одинаковой степени ингибируют значение ОП-525 на 50% по сравнению с клеточным контролем при концентрации препарата 62,5 мкг/мл. (Табл.1)

1.3. Изучение противовирусной активности БЭС в отношении вирусов гриппа А/Н5 и А/Н7 в культуре клеток МДСК в зависимости от длительности контакта с препаратом.

Противовирусную активность и действие БЭС в отношении ВГ А/Н5 и А/Н7 изучали в культуре клеток МДСК.

Полученные результаты влияния различных концентраций (БЭС) на репродукцию вируса гриппа А/Н5 и А/Н7 представлены в таблице 2. (БЭС) в различных концентрациях от 10 до 50 мкг/мл оказывает более слабое действие на репродукцию вируса гриппа А/Н5 и А/Н7 по сравнению с ремантадином, который ингибировал репликацию вирусов гриппа A/duck/Altai/1285/91 (H5N3) и A/FPV/Rostok/(H7N1) в культуре клеток МДСК, о чем свидетельствует величина ОП₄₅₀. При концентрации ремантадина 5 мкг/мл составляет 65% и 72% соответственно.

Исследовано влияние времени контакта препарата БЭС (24 ч, 6 ч, 3 ч и 1 ч) в различных концентрациях с клетками МДСК на репродукцию вирусов гриппа А/Н5 и А/Н7. Из данных, представленных в таблице 3, видно, что БЭС в различных концентрациях от 10 до 50 мкг/мл оказывал несущественное действие на репродукцию вирусов гриппа A/duck/Altai/1285/91 (H5N3) и A/FPV/Rostok/(H7N1), подавляя величину ОП-450 на 8-20%.

1.4. Влияние препарата БЭС на репродукцию вирусов гриппа А птиц в куриных эмбрионах.

При изучении действия препарата БЭС на репродукцию различных штаммов вирусов гриппа А 10-дневные куриные эмбрионы инфицировали 0,2 мл вирусов, разведенных 10-кратным шагом (10^-1-10^-10 ЭИД/0,2 мл). В каждый эмбрион вносили препарат в концентрации: 20-250 мкг/эмбрион или плацебо (физиологический раствор). После инкубации при 37°С в течение 48 часов определяли наличие вируса в реакции гемагглютинации (РГА). Титр вируса представлен в lg ЭИД₅₀/0,1 мл.

В результате проведенных исследований установлено (табл.4), что БЭС в концентрациях 20-250 мкг/мл не оказывает существенного вирусспецифического действия на репродукцию вирусов гриппа А/утка/Алтай/1285/91(H5N3), А/ВЧП/ Росток/34(Н7N1). Инфекционный титр вируса при одновременном введении соединения в КЭ не снижался. Отмечалось существенное изменение функциональных свойств вируса, а именно способность агглютинировать эритроциты. Гемагглютинирующая активность при концентрации 50-100 мкг/мл снижалась на 2-4 log₂ в сравнении с контролем. При более высоких концентрациях БЭС (150 и 250 мкг/мл) гемагглютинирующая активность оставалась на уровне контроля вируса, а инфекционный титр вируса незначительно увеличивался (на 0,25-0,5 lgЭИД₅₀/0,1 мл) в случае вируса (H5N3)).

1.5. Вирулицидное действие БЭС на вирусы гриппа птиц А: Н5 и Н7.

Вирулицидное действие, т.е. связывание препарата с интактными вирусными частицами, которое препятствует дальнейшему развитию инфекционного процесса в клетке, играет значительную роль в проявлении противовирусной активности препаратов.

Изучали вирулицидное действие препарата БЭС на штаммы вируса гриппа А птиц: А/утка/Алтай/1285/91 (H5N3), А/ВЧП/Росток/34(Н7N1). В качестве дополнительного контроля изучали вирулицидное действие ремантадина в аналогичных условиях.

Вируссодержащую жидкость в отсутствие и в присутствие препаратов инкубировали 17 часов при 37°С, после чего определяли инфекционный титр путем заражения КЭ.

Полученные данные представлены в таблице 5. Из представленных данных видно, что БЭС оказывает вирулицидное действие в отношении вирусов гриппа А/утка/Алтай/1285/91 (H5N3), A/ВЧП/Росток/34(H7N1). В качестве дополнительного контроля изучали вирулицидное действие известного противовирусного препарата ремантадина в аналогичных условиях.

При указанных в таблице концентрациях БЭС, в отличие от ремантадина, наблюдалось снижение инфекционного титра вируса гриппа А/утка/Алтай/1285/91(H5N3) в КЭ на 1,0-1,75 lg ЭИД₅₀/0,1 мл.

БЭС, в отличие от ремантадина, оказывал вирулицидное действие в отношении вируса гриппа А/ВЧП/Росток/34(Н7N1). Препарат в концентрациях 20 и 50 мкг/мл снижал инфекционный титр вируса в КЭ на 0,75-1,75 Ig ЭИД₅₀/0,1 мл в сравнении с вирусным контролем.

II. Исследования in vivo

2.1. Материалы и методы

Изучение лечебно-профилактическо активности "Бересты экстракта сухого" (БЭС) проведено в опытах in vivo на модели гриппозной пневмонии мышей согласно "Методическим указаниям по изучению противовирусной активности фармакологических веществ" (Гуськова Т.А., Николаева И.С., Петерс В.В. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва. Ремедиум, 2000, стр.274-278).

Для проведения исследований был использован вирус гриппа А/утка/Алтай/1285/91(H5N3), изолированный от диких птиц. Вирус культивировали в аллантоисной полости 10-дневных куриных эмбрионов (КЭ). В эксперименте использовали белых беспородных мышей женского пола массой 16-18 г. БЭС вводили per os 1 раз в день в дозах 100 и 200 мкг/мл в 0,2 мл 1% крахмального геля за 72, 48, 24, 1 час до и 24, 48, 72 часа после инфицирования мышей вирусом гриппа. Мышам контрольной группы (10 штук) вводили в тех же условиях плацебо (0,2 мл 1% крахмального геля). Всего в эксперименте использовано 30 мышей.

Заражение мышей вирусом гриппа А/утка/Алтай/1285/91(H5N3) проводили интраназально через час после последнего профилактического введения БЭС в дозе 1 LD₇₀ под легким эфирным наркозом в объеме 0,05 мл. За животными проводили наблюдение в течение 14 дней после заражения, учитывая гибель мышей от гриппозной пневмонии в группах леченых животных и контроле. Для более подробного изучения противовирусной активности препарата использовали не 100% летальную дозу вируса, а дозы, вызывающие 70% летальность мышей.

Специфичность гибели животных от гриппозной пневмонии подтверждали регистрацией паталогоанатомических изменений в легких павших животных опытной и контрольных групп.

Активность исследуемого препарата оценивали, сравнивая летальность у животных, принимавших препарат, и в контрольной группе. Снижение летальности леченых животных по отношению к контролю выражали в процентах. Кроме того, учитывали различия в средней продолжительности жизни опытных и контрольных животных.

Статистическую обработку результатов проводили, определяя достоверность разницы средних величин продолжительности жизни животных по таблице Стъюдента.

2.2. Результаты

Результаты исследования лечебно-профилактического действия БЭС представлены в таблице 6.

В контрольной группе гибель мышей от гриппозной пневмонии началась на 3-й день после заражения. Погибло 70% мышей. Средняя продолжительность жизни в группе контроля составила 6,3 дня. В результате проведенных исследований установлено, что БЭС в концентрации 200 мг/кг при однократном пероральном введении за 72, 48, 24, 1 час до и 24, 48, 72 после инфицирования оказывает отчетливое защитное действие в отношении экспериментальной гриппозной инфекции, вызванной вирусом гриппа А/Н5. Выживаемость инфицированных мышей, принимающих БЭС в концентрации 200 мг/кг, по сравнению с контролем увеличилась на 70%.

2.3. Патологоанатомические изменения в легких инфицированных животных.

Легкие животных, павших от гриппозной инфекции в контроле, увеличены в размере, красные, плотные. Специфическая степень поражения составляет 3,5 балла. В легких мышей, леченных препаратом в дозе 100 мг/кг, отмечаются прикорневые очаги поражения и степень поражения оценивалась в 2 балла. В легких выживших животных отмечались единичные мелкоочаговые пораженные участки. Применение препарата в дозе 200 мг/кг по лечебно-профилактической дозе сопровождалось инфицированием мышей с последующим выздоровлением при гибели мышей в контрольной группе.

2.4. Выявление титра антител в сыворотке крови у выживших мышей в реакции иммуноферментного анализа.

Наличие очагов в легких и последующее выздоровление мышей предполагало выработку специфических защитных антител. Для выяснения этого предположения проведено определение титра антител в сыворотке крови оставшихся в живых мышей на 14 день после инфицирования в реакции иммуноферментного анализа. На 96-луночные планшеты сорбировали вирус гриппа А/утка/Алтай/1285/91(H5N3) в бикарбонатном буфере (КББ, рН 9,2) в объеме 100 мкл. Через 24 часа планшеты 3 раза отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ, PBS с 0,05% TWEEN 20). Эти и все дальнейшие процедуры отмывки проводили указанным раствором. Затем в лунки вносили по 100 мкл сыворотки в растворе PBS с 1% фетальной сыворотки и 0,05% TWEEN 20 в различных разведениях. Также в лунки внесли отрицательный и положительный контроли в растворе PBS с 1% фетальной сыворотки и 0,05% TWEEN 20. После инкубации с антителами в течение 1 часа при 37°С лунки промывали и вносили по 100 мкл IgG кролика против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена в разведении 1:1000. После 4-кратной отмывки лигированную пероксидазу выявляли добавлением в лунки 100 мкп ТМБ (33'55' Тетраметилбензидин - субстратный буфер). Реакцию учитывали по оптической плотности при 450 нм в спектрофотометре фирмы "Биоком". Каждое разведение сыворотки исследовали в 2-х повторах, для которых вычисляли среднее значение ОП-450.

Промышленная применимость

Результаты исследований свидетельствуют о том, что экстракт бересты оказывает профилактическое действие при гриппозной пневмонии мышей, обусловленной вирусом гриппа птиц A/H5N3 при использовании заражающей дозы 1 LД₇₀. Защитный эффект находится в зависимости от дозы препарата и при концентрации препарата 200 мг/кг составил 70% по сравнению с контролем.

Лечебно-профилактическое введение препарата способствовало увеличению срока жизни мышей по сравнению с контрольной группой:

при концентрации препарата 100 мг/кг - на 2,3 дня;

при концентрации 200 мг/кг сопровождалось выживанием 70% животных.

Лечебно-профилактическое введение препарата сопровождалось значительным снижением интенсивности поражения легких у леченых мышей (единичные очаги) по сравнению с контрольной группой.

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности применения экстракта бересты в качестве эффективного средства для профилактики и лечения вирусного гриппа птиц.

Таблица 1.
Изучение цитотоксического действия ремантадина в культуре клеток MDCKПрепаратыЦТД₅₀ (мкг/мл)Метод визуального определенияМетод с использованием нейтральротаБЭС
Ремантадин60
6062,5
62,5

Таблица 2.
Влияние БЭС на репродукцию различных штаммов вируса гриппа А птиц при множественности заражения 0,01 ЭИД_50/кл в культуре клеток МДСК.ШтаммПроцент ингибирования ОП-450БЭС (10 мкг/мл)БЭС (20 мкг/мл)БЭС (50 мкг/мл)Ремантадин (10 мкг/мл)A/duck/Altai/1285/91 (H5N3)5%10%12%65%A/FPV/Rostok/(H7N1)8%15%16%72%

Таблица 3.
Влияние БЭС на репродукцию вирусов гриппа птиц А/Н5 и А/Н7 в клетках МДСК в зависимости от времени добавления препаратаВремяПроцент ингибирования ОП-450A/duck/Altai/1285/91 (H5N3)A/FPV/Rostok/(H7N1)Концентрация БЭС, мкг/млКонцентрация БЭС, мкг/мл50201050201024 часа20%15%13%24%15%13%6 часов21%14%13%19%17%8%3 часа15%9%3%13%12%5%1 час16%11%3,5%15%11%8%

Таблица 4.
Влияние БЭС на репродукцию вирусов гриппа А в КЭ.ВирусыКонцентрация БЭЖ (мкг/эмбрион)02005001500250А/утка/Алтай/1285/91 (H5N3)9,09,09,09,09,09,259,09,5А/ВЧП/Росток/(Н7N1)--7,57,57,57,57,57,5В таблице представлены средние результаты трех опытов.

Таблица 5.
Вирулицидное действие БЭС на вирусы гриппа А в КЭ.ВИРУСЫТитр вируса, ЭИД₅₀/0,1 млИсходный*После инкубации 17 ч при 37°СБез препаратов+ БЭС (10 мкг/мл)+ БЭС (20 мкг/мл)+ БЭС (50 мкг/мл)+ римантадин (20 мкг/мл)А/утка/Алтай/1285/91 (H5N3)10⁴10^4,2510^3,2510^2,7510^2,510^4,25А/ВЧП/Росток/34(Н7N1)10⁴10^5,2510^4,510^3,510^3,510^5,25В таблице представлены средние результаты трех одинаковых опытов.
* - рабочее разведение вируса.

Таблица 6
Лечебно-профилактическо действие «Бересты экстракта сухого» на модели гриппозной пневмонии мышей, обусловленной вирусом гриппа птиц А/Н5.Группа животныхДоза препарата, мг/млКоличество животныхВыживаемость, %Средняя продолжительность жизни, дни (M+m)БЭС10010408,6+1,9БЭС200107011,1+2,5Контроль (плацебо)-10306,3+1,1

Таблица 7
Титр антител у мышей к вирусу гриппа А/утка/Алтай/1285/91 (H5N3) в ИФА.Группа животныхIgGБЭС 100 мг/кг1:1600БЭС 200 мг/кг1:3200Контроль (плацебо)1:3200

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к средствам для профилактики и лечения гриппа птиц. В качестве средства для профилактики и лечения вирусного гриппа птиц предложено применение экстракта бересты. Изобретение обеспечивает повышение противовирусной активности средства. 7 табл.

Применение экстракта бересты в качестве средства для профилактики и лечения вирусного гриппа птиц.