СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ НЕКРОБАКТЕРИОЗА ЖИВОТНЫХ Российский патент 1995 года по МПК A61K39/02 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой способ получения вакцины, используемой для профилактики некробактериоза животных.

Некробактериоз инфекционное заболевание, поражающее все виды с/х животных и прежде всего северных оленей, крупный рогатый скот, овец, свинец. Заболевание сопровождается гнойно-некротическим поражением нижних отделов конечностей, при генерализованной форме поражается ротовая полость, внутренние органы, головной мозг.

Ежегодно некробактеризом заболевает от 20 до 40% домашних оленей. Во многих регионах страны регистрируют до 15-30% и более больных некробактериозом овец и крупного рогатого скота. При этом животные теряют упитанность, продуктивность, подавляющая часть подвергается преждевременному вынужденному убою. Несмотря на то, что разработкой специфических средств борьбы с данным заболеванием занимались многие отечественные и зарубежные исследователи [1-3] все работы заканчивались на стадии лабораторных экспериментов и имели весьма противоречивые результаты. Был разработан способ приготовления противонекробактериозной вакцины, наработаны и испытаны в производственных условиях на северных оленях и крупном рогатом скоте лабораторные и опытно-промышленные партии.

Вакцина показала высокую профилактическую эффективность, однако при приготовлении опытно-промышленных партий выявилась нетехнологичность способа. Так, очень трудоемка и длительна операция по извлечению комплексных водорастворимых антигенов. Полученную сухую биомассу следует разбивать на небольшие партии (по 200 г), заливать дистиллированной водой и 3-4 раза пропускать через дезинтегратор, каждый раз перенося смесь из дезинтегратора в центрифужные стаканы, уравновешивая их, центрифугируя по 30 мин, затем после отделения надосадка (антиген) вновь возвращая с новой порцией дистиллированной воды в дезинтегратор. Много труда и времени занимает 3-кратная обработка биомассы ацетоном (при такой же кратности последующего центрифугирования, высок расход ацетона, что значительно повышает себестоимость вакцины. В условиях промышленного производства оказалась невозможной и операция по диализу антигенов против водопроводной и дистиллированной воды. Все перечисленное ставит под вопрос возможность большеобъемного серийного промышленного производства вакцины указанным способом.

Целью изобретения является повышение технологичности способа изготовления противонекробактериозной вакцины, снижение затрат труда и времени на ее производство.

Поставленная цель достигается тем, что в способе изготовления вакцины против некробактериоза, включающем раздельное выращивание производственных культур Fusobacterium necrophorum разных серотипов, отделение биомассы от культуральной жидкости, разрушение микробной клетки, оптимизацию антигенов по количеству микробного белка, смешивание антигенов в равных по белку объемах и адсорбирование, согласно изобретению используют нативную биомассу, разрушают микробную клетку воздействием на ее оболочку ферментом в водной среде, центрифугируют, надосадок инактивируют формалином, разводят дистиллированной водой до необходимой концентрации белка, к полученным комплексным водорастворимым антигенам после объединения добавляют гидроокись алюминия при следующем соотношении компонентов на 1 л вакцины, Комплексные водорастворимые антигены F.necrophorum I серотипа 30-40 Комплексные водорастворимые антигены F.necrophorum II серотипа 30-40 Формалин 0,3-0,4 Гидроокись алюминия (3-ный р-р) 25-30
П р и м е р 1. Для изготовления противонекробактериозной вакцины использовали штаммы Fusobacterium necrophotum Н-89-5 и Н-89-29, относящиеся к I и II серотипам, полученные от северных оленей. Штаммы депонированы ВГНКИ вет. препаратов в коллекции микроорганизмов НИИСХ Крайнего Севера. Производственные штаммы выращивали в реакторах раздельно на среде Китт-Тароцци (рН 7,4-7,6) в течение 36-48 ч при температуре 37-38^оС. Из реактора культуру подавали на суперцентрифугу, культуральную жидкость уничтожали, а нативную биомассу собирали в стерильную емкость, добавляли стерильную дистиллированную воду, и ставили на 1-2 сут в холодильник. После этого раствор подогревали, подщелачивали и добавляли фермент протосубтиллин. ГХ-3 с активностью не менее 100 ед. Смесь тщательно перемешивали и выдерживали в термостате в течение 1,5-2 ч, взбалтывая через каждые 20 мин и периодически отбирая пробы на белок. При достижении в растворе нужной концентрации белка гидролиз прекращали. Закончив гидролиз, раствор биомассы центрифугировали при 3 тыс. оборотах в минуту, осадок уничтожали, а надосадок сливали в емкость, добавляли 0,4% формалина и ставили в термостат на 3-5 дней. По окончании этого срока определяли содержание белка, доводя его до необходимой концентрации добавлением стерильной дистиллированной воды. Растворы антигенов обоих серотипов объединяли в равных по белку и объему соотношениях (50:50), добавляли к смеси 30% гидроокиси алюминия, тщательно перемешивали в течение 2-3 ч и оставляли при комнатной температуре на 2-3 дня, проверяя полноту адсорбции. Содержание несвязанного белка в вакцине не должно превышать 1,2 мг/мл. Вакцину проверяли на стерильность, безвредность, после чего расфасовывали и этикетировали.

Таким образом в примере 1 конкретного выполнения вакцина содержала 30% гидроокиси алюминия (ГОА) и по 35% каждого из антигенов.

П р и м е р 2. Все приемы способа (выращивание производственных культур, получение биомассы, оптимизацию антигенов по белку, адсорбирование) осуществляют аналогично операциям, описанным в примере 1, на разрушение микробной клетки ведут панкреатином, добавляя его из расчетa 10,5-13,5 г (в зависимости от активности) на 100 г микробного белка. Выход антигена из 100 г биомассы при использовании панкреатина оказался равным таковому при использовании протосубтиллина, однако панкреатин разрушает не только микробную стенку, но и ведет к разрушению внутриклеточного белка и большому накоплению аминного азота (до 350-400 мг/%) в растворах антигена.

П р и м е р 3. Все приемы способа (выращивание производственных культур, получение биомассы, разрушение микробных клеток, оптимизацию антигенов по белку) осуществляли аналогично операциям, описанным в примере 1, но антигены брали в соотношении один к другому нe 55:55, а 40:60. Однако, как показали исследования сывороток, взятых от кроликов, иммунизированных такими вакцинами, количество антител на антиген, взятый в меньшем объеме, уступало таковым, образованным на антиген, взятый в большем объеме, что вело к некоторому увеличению числа заболевших некробактериозом иммунизированных животных при заражении их штаммом, аналогичным антигену, введенному в вакцину в меньшей концентрации.

П р и м е р 4. Все приемы способа осуществляли аналогично операциям, описанным в примере 1, но долю адсорбента в вакцине брали равной 20 и 35% В первом случае это вело к значительному увеличению в вакцине несвязанного белка (свыше 2 мг/мл) и, таким образом, к повышению токсичности вакцины и гибели лабораторных животных в ответ на подкожное введение в дозах, необходимых при контроле вакцины в соответствии с техническими условиями. Во втором случае доля несвязанного белка снижалась по сравнению с использованием 30% ГОА незначительно (на 0,1-0,2 мг/мл), однако увеличивало в вакцине и так высокое содержание адсорбента при соответствующем снижении основного действующего вещества-антигена.

П р и м е р производственной проверки. В период с февраля 1991 г. по март 1992 г. на Краснодарской биофабрике было изготовлено 6 опытно-промышленных серий противонекробактериозной вакцины, в том числе четыре серии (1-4) на основе антигенов, выделенных из микробных клеток механическим (гомогенизатор, коллоидная мельница) и две (5-6) ферментативным путем по заявляемому способу. Письмом от 24.04.92 N 22-4/339 Главное управление ветеринарии РФ разрешило провести комиссионные испытания вакцины в Краснодарском крае, где в шести хозяйствах пяти районов было привито около 13 тыс.голов крупного рогатого скота вакциной серий 1-4 и около 2 тыс. 5, 6. Хозяйства много лет подряд неблагополучны по некробактериозу, ежегодная заболеваемость поголовья составляет 25-30% Вакцину вводили подкожно, в среднюю треть шеи, одно- и двукратно в дозе 6 мл. Результаты испытаний показали, что все серии обладают высокой профилактической активностью, снижая заболеваемость в 17-50 раз, либо вообще предохраняя от некробактериоза 100% поголовья, причем ферментные вакцины не уступали по активности, а в некоторых случаях даже превосходили вакцину, приготовленную на основе антигенов, полученных при механическом разрушении микробных клеток.

Таким образом, данные комплексной производственной проверки подтвердили, что заявляемый способ позволяет получать высокоэффективную инактивированную вакцину против некробактериоза животных.

Использование: ветеринарная микробиология, способ получения вакцины, профилактика некробактериоза животных. Сущность изобретения: вакцина содержит в качестве антигенов адсорбированные комплесные водорастворимые антигены, извлекаемые из микробных клеток штаммов Fusobacterium necrophorum Н-89-5 и Н-89-29 ДЕП НИИСХ Крайнего Севера, относящихся к I и II серотипам, путем воздействия фермента, разрушающего клеточную оболочку. Штаммы выращивают раздельно, биомассу отделяют от культуральной жидкости, микробные клетки разрушают, антигены оптимизируют по количеству микробного белка, смешивают их в равных по белку объемах и адсорбируют. При этом микробные клетки разрушают воздействием на ее оболочку ферментом в водной среде, центрифугируют, надосадок инактивируют формалином, разводят дистиллированной водой, к полученным комплексным водорастворимым антигенам после объединения добавляют 30% гидроокиси алюминия (3%-ный раствор) при следующем соотношении компонентов на 1 л вакцины в об. комплексный водорастворимый антиген Fusobacterium necrophorum I серотипа 30 40, комплексный водорастворимый антиген Fusobacterium necrophorum II серотипа 30 40, формалин 0,3 0,4, гидроокись алюминия (3%-ный раствор) 25 30.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ НЕКРОБАКТЕРИОЗА ЖИВОТНЫХ, включающий раздельное выращивание производственных культур Fusobacterium necrophorum I и II серотипов, отделение биомассы от культуральной жидкости, разрушение микробных клеток, выделение комплексных водорастворимых антигенов из жидкой фракции, стандартизацию полученных антигенов по количеству микробного белка, смешивание их в равных соотношениях по белку, добавление адъюванта-адсорбента с получением целевого продукта, отличающийся тем, что разрушение проводят с помощью протеолитического фермента, выделенные антигены инактивируют формалином, в качестве адъюванта-адсорбента используют 3%-ный раствор гидроксида алюминия и получают целевой продукт следующего состава, об.

Комплексный водорастворимый антиген Fusobacterium necrophorum I серотипа 30 40
Комплексный водорастворимый антиген Fusobacterium necrophorum II серотипа 30 40
Формалин 0,3 0,4
Гидроксид алюминия (3%-ный раствор) 25 30