АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА "НЕКОВАК" ПРОТИВ НЕКРОБАКТЕРИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 1997 года по МПК A61K39/116 C12N1/20 A61K39/116 A61K39/02 A61K39/05 A61K39/08 A61K39/85 C12N1/20 C12R1/04 C12R1/145 C12R1/15 C12R1/445 

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной микробиологии и касается новой вакцины для активной иммунизации животных с профилактической и терапевтической целью против некробактериоза конечностей крупного рогатого скота.

Одной из характерных особенностей инфекционных заболеваний конечностей рогатого скота является одновременное, ассоциированное воздействие на организм двух, трех и более видов анаэробов и аэробов, образующих синергитическую ассоциацию, что приводит к тяжелому, злокачественному течению некробактериоза и наносит значительный экономический ущерб.

Известна вакцина для профилактики некробактериоза крупного рогатого скота, содержащая в качестве антигенов эндотоксин и экзотоксин, выделенные из возбудителей некробактериоза (F.necrophorum), инактиватор формалин, физиологический раствор и адъювант на основе минерального масла и ланолина [1]
Известна вакцина против некробактериоза сельскохозяйственных животных, содержащая комплексные водорастворимые антигены из штаммов F.necrophorum I и II серотипов, формалин, адсорбент латекс и адъювант [2]
Однако известные вакцины содержат антигены одного вида возбудителя и не позволяют надежно профилактировать некробактериоз, вызываемый ассоциацией анаэробных микроорганизмов и гнойно-раневой микрофлоры.

Наиболее близким аналогом является вакцина для профилактики некробактериоза крупного рогатого скота, содержащая инактивированные формалином антигены Fusobacterium necrophorum, Staph. aureus, Corynebac. pyogenes, Clostridium perfringens типа А, анатоксин Сl. perfringens типа А, адъювант гидроокись алюминия и иммуностимулятор ГМДП (N-ацетилглюкозаминил-(β1-4)-N-ацетилмурамил-Z-аланин-D-изоглутамин) [3]
Недостатком известной ассоциированной вакцины является недостаточно высокая эффективность вследствие неполноценности антигенного состава входящих в нее компонентов.

Задачей изобретения является получение аппарата, обладающего высокой иммуногенной активностью, стабильными свойствами и широким спектром протективного действия, обеспечивающего защиту крупного рогатого скота от некробактериоза, вызываемого различными ассоциациями возбудителей.

Технический результат изобретения заключается в повышении иммуногенной активности, стабильности и расширении иммуногенного спектра ассоциированной вакцины "Нековак", способной обеспечить длительный и надежный иммунитет против некробактериоза крупного рогатого скота.

Сущность изобретения заключается в следующем: ассоциированная вакцина "Нековак" в качестве антигенов содержит инактивированные культуры штаммов микроорганизмов, отобранных по широте иммуногенного спектра и селекционированных по признаку максимальной иммуногенной и антигенной активности, а именно штаммов: Fusobacterium necrophorum ВГНКИ N "Кр-1" ДЕП и/или Fusobacterium necrophorum ВГНКИ N "Тула" ДЕП, Actinomyces (Corybacterium) pyogenes ВГНКИ N 4/2334 ДЕП, Staphylococcus aureus ВГНКИ N 7315 ДЕП, Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 28 ДЕП. Вакцина содержит также анатоксин из штамма Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 28 ДЕП и адъювант гидроокись алюминия. Кроме того, вакцина содержит солевой раствор, например физиологический раствор.

Дополнительно вакцина "Нековак" может содержать иммуностимулятор ГМДП.

Bcе антигены входят в состав вакцины в эффективном количестве.

В частности, ассоциированная вакцина "Нековак" содержит компоненты в следующем соотношении (об.):
инактивированный формалином антиген из штамма F.necrophorum ВГНКИ N "Кр-1" -ДЕП и/или F.necrophorum ВГНКИ N "Нева" с титром 3•10⁹ - 5•10⁹кл/мл 15-20,
инактивированный формалином антиген из штамма Staphylococcus anreus ВГНКИ N 7315 ДЕП с титром 1,5•10⁹ 2,5•10⁹ кл/мл 15-20,
инактивированный формалином антиген из штамма Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes ВГНКИ N 4/2334 -ДЕП с титром 1,5 •10⁹ - 2,5•10⁹ кл/мл 15-20,
инактивированный формалином антиген из штамма Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 28 -ДЕП с титром 0,5•10⁹ 1,5•10⁹ кл/мл 10-15,
анатоксин из штамма Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 28 ДЕП - 10-20,
гидроокись алюминия 12-16,
физиологический раствор остальное.

Производственный штамм Fusobacterium necrophorum "Кр-1" выделен из больной конечности крупного рогатого скота.

Штамм F. necrophorum "Кр-1" депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер "Кр-1" -ДЕП.

Штамм Fusobacterium necrophorum ВГНКИ N "Кр-1" -ДЕП характеризуется следующими свойствами:
Морфологические свойства. Тонкие грамотрицательные палочки или нити. Микроб неподвижен, спор и капсул не образует.

Культурально-биохимические свойства. Строгий анаэроб. На среде Китта-Тароцци растет при температуре 37^oC, где через 24-48 ч появляется равномерное помутнение с возможным газообразованием и хлопьевидный осадок на кусочках печени. На аэробных средах не растет. Образует индол и сероводород. Не разжижает желатин. Ферментирует слабо глюкозу. Другие сахара и аминокислоты не ферментирует.

Вирулентные свойства. Патогенен для кроликов погибают через 12-14 дней после заражения суточной культурой штамма в основание ушной раковины. На внутренних органах павших животных выделяется чистая культура штамма.

Антигенная активность. Титр антител у кроликов, двукратно иммунизированных инактивированным штаммом, в реакции аглютинации (РА) составляет в среднем 1:800 (но не менее 1:400).

Производственный штамм Fusobacterium necrophorum "Тула" получен из больной конечности крупного рогатого скота.

Штамм Fusobacterium necrophorum "Тула" депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер "Тула" ДЕП.

Штамм F. necrophorum ВГНКИ N "Тула" ДЕП характеризуется следующими свойствами:
Морфологические свойства. Грамотрицательные зернисто окрашенные тонкие палочки и кокковидные формы. Спор и капсул не образует.

Культурально-биохимические свойства. Строгий анаэроб. На среде Китта-Тароцци растет при температуре 37^oC, где через 24-48 ч появляется равномерное помутнение с возможным газообразованием.

Штамм ферментирует сахарозу, рафинозу, лактозу и слабо глюкозу. Другие сахара и аминокислоты не ферментирует.

Вирулентные свойства. Патогенен для кроликов погибают через 13-16 дней после заражения суточной культурой штамма в основание ушной раковины. На внутренних органах павших животных выделяется чистая культура штамма.

Антигенная активность. Титр антител у кроликов, двукратно иммунизированных инактивированным штаммом в РА, составляет в среднем 1:800.

Производственный штамм Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes N 4/2334 выделен из абортированного плода крупного рогатого скота и депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов. Штамму присвоен регистрационный номер 4/2334 ДЕП.

Штамм Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes ВГНКИ N 4/2334-ДЕП характеризуется следующими свойствами:
Морфологические свойства. Мелкие грамположительные палочки или кокковидные бактерии, располагающие одиночно, попарно, кучками или большими скоплениями, неподвижны. Спор и капсул не образуют, характерным признаком является наличие V-образных форм.

Культурально-ферментативные свойства. Аэроб, факультативный анаэроб. На мясо-пептонном бульоне (МПБ) с добавлением 10%-ной сыворотки через 24 ч дает равномерное помутнение, через 48 ч на дне образуется крошковатый белый осадок. На мясо-пептонном агаре (МПА) через 24-48 ч образует прозрачные росинчатые колонии. На кровяном агаре через 48 ч формируются росинчатые гладкие блестящие колонии с зоной b-гемолиза.

Штамм ферментирует глюкозу, мальтозу, лактозу.

Вирулентные свойства. Патогенен для белых мышей подкожное введение суточной культуры вызывает их гибель на 5-6-й день.

Производственный штамм Staphylococcus aureus N 7315 выделен от больной некробактериозом коровы. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер 7315-ДЕП.

Штамм Staphylococcus aureus ВГНКИ N 7315 ДЕП характеризуется следующими свойствами:
Морфологические свойства. Крупные грамположительные кокки, спор и капсул не образуют, располагаются одиночно или в виде виноградных гроздьев, неподвижны.

Культурально-ферментативные свойства. Аэроб, факультативный анаэроб. При температуре 37^oC на МПБ образуется равномерное помутнение с последующим образованием белого аморфного осадка. На МПА растет в виде мелких белых, с золотистым оттенком выпуклых колоний с ровными краями. На кровяном агаре образуются круглые, слегка выпуклые желто-золотистые колонии с ровными краями. Вокруг колоний образуются зоны b-гемолиза.

Штамм пептонизирует и свертывает молоко. Двадцатичасовая культура коагулирует кроличью плазму. Ферментирует маннит, глюкозу, мальтозу, сахарозу.

Вирулентные свойства. Патогенен для белых мышей при подкожном заражении одно-полуторасуточная культура вызывает их гибель на 3-5-й день.

Производственный штамм Clostridium perfringens типа А N 28 депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер 28 -ДЕП.

Штамм Cl.perfringens типа А ВГНКИ N 28 ДЕП имеет следующие свойства:
Морфологические свойства. Крупные грамположительные палочки с обрубленными или слегка закругленными концами, расположенные в форме полисада или попарно, неподвижны, образуют споры.

Культурально-ферментативные свойства. Строгий анаэроб. Хорошо растет на среде Китта Тароцци с бурным газообразованием. Через 6-8 ч рост завершается, прекращается выделение газов. На поверхности кровяного агара в анаэробных условиях через 12-18 ч образуются крупные колонии сероватого цвета, окруженные одной или двумя световыми зонами гемолиза, которые при выдерживании на воздухе приобретают зеленоватый оттенок, что является характерным для этого вида микроорганизмов.

Штамм ферментирует глюкозу, лактозу, галактозу, левулезу, сахарозу, мальтозу.

Вирулентные свойства. Патогенен при подкожном заражении для всех видов лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Пример 1. Основой изготовления ассоциированной вакцины "Нековак" служат штаммы F.necrophorum ВГНКИ N "Кр-1"-ДЕП и/или F.necrophorum ВГНКИ N "Нева" - ДЕП, Staph. aurens ВГНКИ N 7315-ДЕП, actinomyces (Corynebacterium) pyogenes ВГНКИ N 4/2334 ДЕП, Cl.perfringens типа А ВГНКИ N 28 ДЕП, взятые в эффективном количестве.

Штаммы отобраны по широте иммуногенного спектра и обеспечивают высокий профилактический и терапевтический эффект.

Для изготовления вакцины производственные штаммы выращивают раздельно на средах, обычно используемых для культивирования соответствующего вида микроорганизмов.

Выращенные культуры проверяют на чистоту роста, после чего инактивируют формалином.

Инактивированные культуры концентрируют, например, центрифугированием. Полученные осадки антигенов раздельно ресуспендируют формалинизированным солевым раствором, например физиологическим раствором, и готовят суспензии клеток каждого инактивированного штамма раздельно.

Для получения анатоксина центрифугат штамма U.perfringens типа А ВГНКИ N 28 ДЕП фильтруют через стерилизующие пластины.

Антигены и фильтрат контролируют на стерильность и чистоту. Фильтрат проверяют также на полноту инактивации.

Полученные антигены инактивированные клетки и анатоксин объединяют в эффективном количестве, перемешивают и к смеси добавляют адъювант гидроокись алюминия. Дополнительно в вакцину может быть добавлен стимулятор ГМДП.

Готовый препарат многократно перемешивают для проведения сорбции, контролируют на стерильность, доводят pH до 6,9 7,2 и расфасовывают.

Пример 2. Вакцину готовят аналогично примеру 1. Выращенные культуры F. necrophorum ВГНКИ N "Кр-1" ДЕП и/или ВГНКИ "Нева" -ДЕП и Cl.perfringens ВГНКИ N 28-ДЕП инактивируют дробным добавлением формалина до его конечной концентрации в культуре 0,5% Культуры стафилококка и коринебактерий инактивируют 0,5% -ным формалинизированным физиологическим раствором при их смыве.

Формалинизированные культуры выдерживают для инактивации. Далее инактивированные культуры концентрируют центрифугированием. Центрифугат клостридиальной культуры собирают в стерильные емкости. Полученные осадки инактивированных клеток раздельно ресуспендируют 0,5% -ным формалинизированным физиологическим раствором, доводят до нужной концентрации и контролируют на стерильность посевами на МПБ, МПА, МППБ и микроскопией.

Анатоксин проверяют на полноту инактивации и определяют активность на белых мышах.

Концентрированные антигены из инактивированных штаммов объединяют с анатоксином, тщательно перемешивают и добавляют гидроокись алюминия из расчета 0,45% его в конечной концентрации.

Полученная в результате вакцина имеет следующий качественный и количественный состав (об.):
инактивированный формалином антиген из штамма F.necrophorum ВГНКИ N "Кр-1" -ДЕП и/или ВГНКИ N "Нева" ДЕП с титром 4.10⁹ кл/мл 15,
инактивированный формалином антиген из штамма Staphylococcus aureus ВГНКИ N 7315 ДЕП с титром 2•10⁹кл/мл 15,
инактивированный формалином антиген из штамма Actinomyces (Corynebac) pyogenes ВГНКИ N 4/2334 ДЕП с титром 2•10⁹ кл/мл 15,
инактивированный формалином антиген из штамма U.perfringens типа А ВГНКИ N 28 ДЕП с титром 1•10⁹ кл/мл 15,
анатоксин из штамма Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 28-ДЕП с активностью 4•10⁴ DZ m/мл 20,
гидроокись алюминия 15,
физиологический раствор 5.

Ассоциированную вакцину "Нековак" вводят животным с профилактической или лечебной целью подкожно в дозе 5 см³, двукратно с интервалом 28-30 дней.

Иммунитет у животных создается к 15-20-му дню после проведения второй вакцинации и сохраняется 6 мес.

Ограничений по убою и использованию молока животных, привитых ассоциированной вакциной "Нековак" против некробактериоза крупного рогатого скота, нет.

Производственные испытания вакцины "Нековак" показали ее высокий профилактический и терапевтический эффект.

Источники информации
1. Патент RU N 1816348, кл. А 61 К 39/02, 1993.

2. Патент RU N 1828598, кл. А 61 К 39/02, 1993.

3. А.с. СССР N 1835295, кл. А 6 1К 39/02, 1993.

Использование: биотехнология, ветеринарная микробиология, вакцина "Нековак" для активной иммунизации животных с профилактической и терапевтической целью против некробактериоза крупного рогатого скота. Сущность изобретения: вакцина в качестве антигенов содержит инактивированные культуры штаммов микроорганизмов, отобранных по широте иммуногенного спектра и селекционированных по признаку максимальной иммуногенной и антигенной активности, а именно штаммов: F.necrophorum ВГНКИ N "Кр-1" - ДЕП и/или F.necrophorum ВГНКИ N "Нева" - ДЕП, Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes ВГНКИ N 4/2334 - ДЕП, Staph.aureus ВГНКЦ N 7315 - ДЕП, Cl.perfringens типа А ВГНКИ N 28 - ДЕП, адъювант - гидроокись алюминия и солевой раствор, например физиологический раствор. Дополнительно вакцина может содержать иммуностимулятор ГМДП. Вакцина "Нековак" стабильна, обладает повышенной иммуногенной активностью и обеспечивает надежный иммунитет против некробактериоза крупного рогатого скота. 4 з.п. ф-лы.

1. Ассоциированная вакцина против некробактериоза крупного рогатого скота, содержащая антигены из инактивированных формалином культур Fusobacterium necrophorum, Staphylococcus aureus, Corynebacterium pyogenes, Clostridium perfringens типа А, анатоксин из штамма Clostridium perfringens типа А и адъювант, отличающаяся тем, что дополнительно содержит солевой раствор, из культуры Fusobacterium necrohorum штамм Fusobacterium necrohorum ВГНКИ N "Нева"-ДЕП и/или Fusobacterium necrophorum ВГНКИ N "Кр-1"-ДЕП, из культуры Staphylococcus aureus штамм Staphylococcus aureus ВГНКИ N 7315-ДЕП, из культуры Corynebacterium pyogenes штамм Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes ВГНКИ N 4/2334-ДЕР, а из культуры Clostridium perfringens типа А - штамм Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 28-ДЕП и анатоксин, взятые в эффективном количестве. 2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из солевых растворов она содержит физиологический раствор. 3. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из адьювантов она содержит гель гидроокиси алюминия. 4. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит иммуностимулятор ГМДП. 5. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что содержит компоненты в следующем соотношении, об.

Инактивированный формалином антиген из штамма Fusobacterium necrophorum ВГНКИ N "Нева"-ДЕП и/или ВГНКИ N "Кр-1"-ДЕП с титром 3 • 10⁹ 5 • 10⁹ кл/мл 15 20
Инактивированный формалином антиген из штамма Staphylococcus aureus ВГНКИ N 7315-ДЕП с титром 1,5 • 10⁹ 2,5 • 10⁹ кл/мл 15 - 20
Инактивированный формалином антиген из Actinomyces (Corynebacterium)pyogenes ВГНКИ N 4/2334-ДЕП с титром 1,5 • 10⁹ - 2,5 • 10⁹ кл/мл 15 20
Инактивированный формалином антиген из штамма Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 28-ДЕП с титром 0,5 • 10⁹ 1,5 • 10⁹ кл/мл 10 15
Анатоксин из штамма Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 28-ДЕП активностью 4 • 10⁴ 6 • 10⁴ DLm/мл 10 20
Гидроокись алюминия 12 16
Физиологический раствор Остальноео