АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА "ОВИКОН" ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КОНЕЧНОСТЕЙ ОВЕЦ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/116 C12N1/20 A61K39/116 A61K39/02 A61K39/05 A61K39/08 A61K39/85 C12N1/20 C12R1/04 C12R1/145 C12R1/15 C12R1/445 

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной микробиологии и касается новой вакцины для профилактики и лечения инфекционных заболеваний конечностей мелкого рогатого скота.

Инфекционные заболевания конечностей овец занимают одно из ведущих мест в инфекционной патологии у этого вида животных. Среди таких заболеваний наибольшее значение имеют копытная гниль и некробактериоз. Часто эти заболевания протекают одновременно, т.к. при заболеваниях конечностей пораженный орган постоянно контактирует с почвой и другими предметами окружающей среды, что приводит к его обильному обсеменению различной бактериальной флорой. К тому же одной из характерных особенностей анаэробных инфекций является одновременное, ассоциированное воздействие на организм двух, трех и более видов анаэробов и аэробов.

Известны вакцины для профилактики и лечения инфекционных заболеваний конечностей овец, в частности копытной гнили, содержащие антиген из Bacteroides nodosus (инактивированные клетки или протеаза) и адъювант [1, 2]
Однако известные моновалентные вакцины не позволяют надежно профилактировать заболевания конечностей овец, вызываемых ассоциацией анаэробных микроорганизмов и гнойно-раневой микрофлоры.

Известна также ассоциированная вакцина "Pietivac" против инфекционных заболеваний конечностей овец, содержащая антигены из инактивированных формалином культур B. nodosus, F. necrophorum, Cl. perfringens, Staph. aureus и адъювант [3]
Недостатком ближайшего аналога является недостаточно высокая эффективность вакцины вследствие неполноценности антигенного состава входящих в нее компонентов.

Задачей изобретения является получение препарата, обладающего высокой иммуногенной активностью и широким спектром протективного действия, тем самым обеспечивающего защиту овец от инфекционных заболеваний конечностей, вызываемых различными ассоциациями возбудителей.

Технический результат изобретения заключается в повышении иммуногенной активности и расширении иммуногенного спектра ассоциированной вакцины "Овикон", способной обеспечить длительный и надежный иммунитет против инфекционных заболеваний конечностей у овец.

Сущность изобретения заключается в следующем: ассоциированная вакцина "Овикон" в качестве антигенов содержит синергитическую ассоциацию возбудителей инфекционных заболеваний конечностей, инактивированных формалином, а именно следующих штаммов: Bacteroides nodosus ВИЭВ N ПП-82/90, Fusobacterium necrophorum ВИЭВ N ПП-82/90, Fusobacterium necrophorum ВГНКИ N "Кр-I"- ДЕП и/или Fusobacterium necrophorum ВГНКИ N "Тула"- ДЕП, Actinomyces (Corynebacterium pyogenes ВГНКИ N 4/2334- ДЕП, Staphylococcus aureus ВГНКИ N 7315-ДЕП, Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 28-ДЕП. Вакцина также содержит анатоксин из штамма Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 128-ДЕП, адъювант и солевой раствор, например физиологический раствор.

Из адъювантов вакцина "Овикон" содержит гидроокись алюминия, однако можно использовать и другие известные адъюванты, например на основе минерального масла и ланолина.

Все антигены входят в состав вакцины в эффективном количестве.

В частности, вакцина "Овикон" имеет следующий состав (об.):
инактивированный формалином антиген из штамма B.nodosus ВИЭВ N ПП-82/90 с титром 3•10⁹ 5•10⁹ кл/мл -15-20,
инактивированный формалином антиген из штамма F.necrophorum ВГНКИ N "Нева"-ДЕП и/или ВГНКИ N "Кр-1"-ДЕП с титром 3•10⁹-5•10⁹ кл/мл 15-20,
инактивированный формалином антиген из штамма Staph. aureus ВГНКИ N 7315-ДЕП с титром 1,5•10⁹-2,5•10⁹ кл/мл 15-20,
инактивированный формалином антиген из штамма Actinom.(Corynebac.) pyogenes ВГНКИ N 4/2334-ДЕП с титром 1,5•10⁹-2,5•10⁹ кл/мл 15-20,
инактивированный формалином антиген из штамма Cl.perfringens типа А ВГНКИ N 28-ДЕП с титром 0,5•10⁹-1,5•10⁹ кл/мл 10-15,
анатоксин из штамма Cl.perfringens типа А ВГНКИ N 28-ДЕП с активностью 4•10⁴ 6•10⁴ DZm/мл 10-20
гель гидроокиси алюминия 12-16,
физиологический раствор остальное.

Производственный штамм Fusobacterium necrophorum "Тула" получен из больной конечности крупного рогатого скота и депонирован в коллекции Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер "Тула"-ДЕП.

Штамм F.necrophorum ВГНКИ имеет следующие свойства.

Морфологические свойства. Грамотрицательные зернисто окрашенные палочки или кокковидные формы. Спор и капсул не образует. Культурально-биохимические свойства. Строгий анаэроб. На среде Китта-Тароцци через 24-48 ч растет с помутнением и газообразованием.

Штамм ферментирует сахарозу, рафинозу, лактозу и слабо глюкозу. Другие сахара и аминокислоты не ферментирует.

Вирулентные свойства. Патогенен для кроликов погибают через 13-16 дней после заражения в основание ушной раковины.

Производственный штамм Fusobacterium necrophorum "Кр-1" выделен из больной конечности крупного рогатого скота.

Штамм F. necrophorum "Кр-1" депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер "Кр-1"-ДЕП.

Штамм Fusobacterium necrophorum ВГНКИ N "Кр-1"-ДЕП характеризуется следующими свойствами:
Морфологические свойства. Тонкие грамотрицательные палочки или нити. Микроб неподвижен, спор и капсул не образует.

Культурально-биохимические свойства. Строгий анаэроб. На среде Китта-Тароцци растет при температуре 37^oC, где через 24-48 ч появляется равномерное помутнение с возможным газообразованием и хлопьевидный осадок на кусочках печени. На аэробных средах не растет. Образует индол и сероводород. Не разжижает желатин. Ферментирует слабо глюкозу. Другие сахара и аминокислоты не ферментирует.

Вирулентные свойства. Патогенен для кроликов погибают через 12-14 дней после заражения суточной культурой штамма в основание ушной раковины. На внутренних органах павших животных выделяется чистая культура штамма.

Антигенная активность. Титр антител у кроликов, двукратно иммунизированных инактивированным штаммом, в реакции агглютинации(PA) не менее 1 400 (в среднем 1 800).

Производственный штамм Bacteroides nodosus ПП-82/90 депонирован в коллекции Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко и характеризуется следующим свойствами:
Морфологические свойства. Грамотрицательные, прямые или слегка изогнутые палочки, располагающиеся одиночно или попарно, длиной 5-10 мкм и шириной 0,4-0,6 мкм, со слегка утолщенными концами у большинства клеток, спор и капсул не образует.

Культуральные свойства. На бульоне и агаре Хоттингера рост отсутствует. При выращивании на мясо-пептонном печеночном бульоне (МППБ) под вазелиновым маслом без агара рост также отсутствует. На МППБ с 0,1% агара под вазелиновым маслом признаки роста появляются через 48-72 ч в виде небольших вертикальных штрихов или тяжей в средней части столбика среды без газообразования. На плотной среде на 3-4 сут культивирования образуются мелкие (1-2 мм в диаметре) плоские, бесцветные, шероховатые колонии, без зоны гемолиза.

Ферментативные свойства. Штамм не ферментирует углеводы и многоатомные спирты с образованием кислоты и газа, не образует индола (индикаторная бумажка без изменений), слабо образует сероводород (край бумажки слегка чернеет), разжижает полностью 20%-ный мясо-пептонный желатин на 3-5 сут, а также свертывает на 2-4 сут и пептонизирует молоко на 8-10 сут.

Вирулентные свойства. Штамм не вызывает заболевания и гибели лабораторных животных (белых мышей, морских свинок, кроликов). При заражении овец в межкопытную щель развивается характерная для данного заболевания клиническая картина.

Серологические свойства. Штамм дает в непрямой реакции флуоресценции (РИФ) специфическое свечение, оцениваемое на три или четыре креста.

Антигенная активность. Титр антител у кроликов, двукратно иммунизированных инактивированным штаммом, составляет в среднем 1 800 (но не менее 1 400) в РА.

Производственный штамм Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes N 4/2334 выделен из абортированного плода крупного рогатого скота и депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского инструмента контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов. Штамму присвоен регистрационный номер Actinomyces (Corybebacterium) pyоgenes ВГНКИ N 4/2334 ДЕП.

Штамм Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes ВГНКИ N 4/2334 ДЕП характеризуется следующими свойствами:
Морфологические свойства. Мелкие грамположительные палочки или кокковидные бактерии, располагаются одиночно, попарно, кучками или большими скоплениями, неподвижны. Спор и капсул не образуют, характерным признаком является наличие V-образных форм.

Культурально-ферментативные свойства. Является аэробом, факультативным анаэробом. На мясо-пептонном бульоне (МПБ) с добавлением 10%-ной сыворотки через 24 ч дает равномерное помутнение, через 48 ч на дне образуется крошковатый белый осадок. На мясо-пептонном агаре (МПА) через 24 48 ч образует прозрачные росинчатые колонии. На кровяном агаре через 48 ч формируются росинчатые гладкие блестящие колонии с зоной β-гемолиза.

Штамм ферментирует глюкозу, мальтозу, лактозу.

Вирулентные свойства. Патогенен для белых мышей подкожное введение суточной культуры вызывает их гибель на 5 6-й день.

Производственный штамм Staphylococcus aureus N 7315 выделен от больной некробактериозом коровы. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер 7315 ДЕП.

Штамм Staphylococcus aureus ВГНКИ N 7315 ДЕП характеризуется следующими свойствами:
Морфологические свойства. Крупные грамположительные кокки, спор и капсул не образуют, располагаются одиночно или в виде виноградных гроздьев, неподвижны.

Культурально-ферментативные свойства. Является аэробом, факультативным анаэробом. При температуре 37^oC на МПБ образуется равномерное помутнение с последующим образованием белого аморфного осадка. На МПА растет в виде мелких белых, с золотистым оттенком выпуклых колоний с ровными краями. На кровяном агаре образуются круглые, слегка выпуклые желто-золотистые колонии с ровными краями. Вокруг колоний образуются зоны b-гемолиза.

Штамм пептонизирует и свертывает молоко. Двадцатичасовая культура коагулирует кроличью плазму. Ферментирует маннит, глюкозу, мальтозу, сахарозу.

Вирулентные свойства. Патогенен для белых мышей при подкожном заражении одно-полуторасуточная культура вызывает их гибель на 3 5-й день.

Производственный штамм Clostridium perfringes типа А N 28 демонтирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер 28 ДЕП.

Штамм Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 28 ДЕП имеет следующие свойства:
Морфологические свойства. Крупные грамположительные палочки с обрубленными или слегка закругленными концами, расположенные в форме полисада или попарно, неподвижны, образуют споры.

Культурально-ферментативные свойства. Строгий анаэроб. Хорошо растет на среде Китта-Тароцци с бурным газообразованием. Через 6 8 ч рост завершается, прекращается выделение газов.

На поверхности кровяного агара в анаэробных условиях через 12 18 ч образуются крупные колонии сероватого цвета, окруженные одной или двумя светлыми зонами гемолиза, которые при выдерживании на воздухе приобретают зеленоватый оттенок, что является характерным для этого вида микроорганизмов.

Штамм ферментирует глюкозу, лактозу, галактозу, левулозу, сахарозу, мальтозу.

Вирулентные свойства. Патогенен при подкожном заражении для всех видов лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Пример 1. Основой изготовления ассоциированной вакцины "Овикон" служат штаммы B. nodosus ВИЭВ N ПП-82/90, F. necrophorum ВГНКИ N "Нева" ДЕП и N "Кр-1" ДЕП, Staph. aureus ВГНКИ N 7315 ДЕП, Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes ВГНКИ N 4/2334 ДЕП, Cl. perfringens типа А ВГНКИ N 28 ДЕП, взятые в эффективном количестве.

Штаммы отобраны по широте иммуногенного спектра и обеспечивают высокий профилактический и терапевтический эффект.

Для изготовления вакцины производственные штаммы выращивают раздельно на средах, обычно используемых для культивирования соответствующего вида микроорганизмов.

Выращенные культуры проверяют на чистоту роста, после чего инактивируют формалином.

Инактивированные культуры концентрируют, например, центрифугированием. Полученные осадки антигенов раздельно ресуспендируют формалинизированным солевым раствором, например физиологическим, и готовят суспензии клеток каждого штамма раздельно.

Центрифугат штамма Cl.perfringens типа А ВГНКИ N 28 ДЕП фильтруют через стерилизующие пластины.

Антигены и фильтрат контролируют на стерильность и чистоту.

Фильтрат Cl. perfringens проверяют на полноту инактивации. Полученные антигены инактивированные клетки и анатоксин соединяют в эффективном количестве, перемешивают и к смеси добавляют известный адъювант, например гидроокись алюминия.

Готовый препарат перемешивают для проведения сорбции, контролируют на стерильность, доводят pH до величины 6,9 7,2 и расфасовывают.

Пример 2. Ассоциированную вакцину "Овикон" готовят аналогично примеру 1.

Выращенные культуры проверяют на чистоту роста микроскопией, после чего в культуры B. nodosus ВИЭВ N ПП-82/90, F. necrophorum ВГНКИ N "Нева" ДЕП и/или N "Кр-1" ДЕП и Cl.perfringens ВГНКИ N 28 ДЕП дробно добавляют формалин до его конечной концентрации в культуре 0,5% Культуры стафилококка и коринебактерий инактивируют 0,5% формалинизированным физраствором при их смыве.

Формалинизированные культуры выдерживают для инактивации. Далее инактивированные культуры концентрируют центрифугированием. Центрифугат клостридиозной культуры собирают в стерильные емкости. Полученные осадки антигенов раздельно ресуспендируют 0,5%-ным формалинизированным физиологическим раствором, доводят до нужной концентрации и контролируют на стерильность посевами на МПБ, МПА, МППБ и микроскопией.

Анатоксин проверяют на полноту инактивации и определяют активность на белых мышах.

Концентрированные антигены из инактивированных штаммов вносят в емкости, содержащие анатоксин Cl. perfringens.

Смесь антигенов тщательно перемешивают и добавляют гидроокись алюминия. Полученная в результате вакцина имеет следующий состав (об.):
инактивированный формалином антиген из штамма B. nodosus ВИЭВ N ПП-82/90 с титром 4•10⁹ кл/мл 15,
"Кр-1" ДЕП и/или ВГНКИ N "Нева" ДЕП с титром 4•10⁹ кл/мл - 15,
инактивированный формалином антиген из штамма F. necrophorum ВГНКИ N "Кр-1"-ДЕП с титром 4•10⁹ кл/мл 15,
инактивированный формалином антиген из штамма Staph.aureus ВГНКИ N 7315
ДЕП с титром 2•10⁹ кл/мл 15,
инактивированный формалином антиген из штамма Act(Cor.)pyogenes ВГНКИ N 4/2334 ДЕП с титром 2•10⁹ кл/мл 15,
инактивированный формалином антиген из штамма Cl. perfringens типа А ВГНКИ N 28 ДЕП с титром 1•10⁹ кл/мл 10,
анатоксин из штамма Cl. perfringens типа А ВГНКИ N 28 ДЕП с активностью 4•10⁴D Zm/мл 10,
гель гидроокиси алюминия 12,
физиологический раствор 8.

Пример 3. Ассоциированную вакцину "Овикон" вводят животным с профилактической или лечебной целью подкожно, в области верхней трети шеи, в дозе 5 см³, двухкратно с интервалом 28 30 дней.

Иммунитет у животных создается к 15 20-му дню после проведения второй вакцинации и сохраняется 6 мес.

Вакцинацию начинают за 1 мес до предполагаемой сезонной вспышки заболевания.

В последующем при необходимости проводят однократные ревакцинации через 6 мес в дозе 5 см³.

Вакцинации подлежат животные с 6-месячного возраста. Суягных овец прививают не позднее одного месяца до начала окота.

Ограничений по убою и использованию молока животных, привитых ассоциированной вакциной "Овикон" против инфекционных заболеваний конечностей овец, нет.

Производственные испытания вакцины показали ее высокий профилактический и терапевтический эффект.

Использование: биотехнология, ветеринарная микробиология, ассоциированная вакцина "Овикон" для профилактики и лечения инфекционных заболеваний конечностей мелкого рогатого скота. Сущность изобретения заключается в следующем: вакцина в качестве антигенов содержит синергитическую ассоциацию возбудителей инфекционных заболеваний конечностей, инактивированных формалином, а именно следующих штаммов: Bacteroides nodosus ВИЭВ N ПП-82/90, Fusobacterium ВГНКИ N "Кр-1" - ДЕП и/или Fusobacterium necrophorum ВГНКИ N "Тула" - ДЕП, Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes ВГНКИ N 4/2334 - ДЕП, Staphylococcus aureus ВГНКИ N 7315 - ДЕП, Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 28- ДЕП, а также анатоксин из штамма Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 28 - ДЕП, адъювант и солевой раствор. В качестве солевого раствора она содержит физиологический раствор, а из адъювантов - гидроокись алюминия или масляный адъювант. Вакцина "Овикон" обеспечивает длительный и напряженный иммунитет против заболеваний конечностей овец, вызываемых различными ассоциациями возбудителей. 5 з.п. ф-лы.

1. Ассоциированная вакцина против инфекционных заболеваний конечностей овец, содержащая антигены из инактивированных культур Bacteroides nodosus, Fusobacterium necrophorum, Stahylococcus aureus, Clostridium perfringens, солевой раствор и адьювант, отличающаяся тем, что дополнительно содержит анатоксины из штамма Clostridium perfringens типа А ВГНКИ 28-ДЕП и инактиварованную культуру штамма Actinomyces (Corynebacterium)pyogenes ВГНКИ N4/2334-ДЕП, из культуры Bacteroidesnodosus штамм Bacteroides nodosus ВИЭВ N ПП82/90, из культуры F.necrophorum F.necrophorum ВГНКИ N "Нева"-ДЕП и/или Fusobacterium necrophorum ВГНКИ N Кр-1-ДЕП, из культуры Staphylococcus aureus штамм Staphy Lococcus aureus ВГНКИ N 7315-ДЕП, а из культуры Clostridium perfringens штамм Clostridium perfringens типа А ВГНКИ N 28-ДЕП, взятые в эффективном количестве. 2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит инактивированные формалином культуры. 3. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из солевых растворов она содержит физиологический раствор. 4. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из адьювантов она содержит гидроокись алюминия. 5. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит гель гидроокиси алюминия. 6. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что содержит компоненты в следующем соотношении, об.

Инактивированный формалином антиген из штамма Bacteroides nodosus ВИЭВ N ПП 82/90 с титром 3 • 10⁹ 5 • 10⁹ кл/мл 15 20
Инактивированный формалином антиген из штамма Fusobacterium necrophorum ВГНКИ N "Нева"-ДЕП и/или Fusobacterium necrophorum ВГНКИ N "Кр-1"-ДЕП с титром 3 • 10⁹ 5 • 10⁹ кл/мл 15 20
Инактивированный формалином антиген из штамма Staphylococcus aureus ВГНКИ N 7315-ДЕП с титром 1,5 • 10⁹ 2,5 • 10⁹ кл/мл 15 - 20
Инактивированный формалином антиген из штамма Actinomyces (Corynebacterium)pyogenes ВГНКИ N 4/2334-ДЕП с титром 1,5 • 10⁹ - 2,5 • 10⁹ кл/мл 15 20
Инактивированный формалином антиген из штамма Clostridium perfringens типа ВГНКИ N 28-ДЕП с титром 0,5 10⁹ 1,5 • 10⁹ кл/мл - 10 15
Анатоксин из штамма Clostridium perfringens типа А ВГНКИМ N 28-ДЕП с активностью 4 • 10⁴ 6 • 10⁴ DZm/мл 10 20
Гель гидроокиси алюминия 12 16
Физиологический раствор ОстальноеГ