СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДИКАТОРНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ АНАЭРОБНЫХ НЕСПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ Российский патент 1995 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается организации рациональной микробиологической диагностики анаэробной неклостридиальной инфекции.

Особенностью микробиологической индикации возбудителей анаэробной неклостридиальной инфекции является необходимость применения сложных по составу искусственных питательных сред, содержащих в качестве стимуляторов микробного роста некоторые аминокислоты, витамины, гемин, а также нативную кровь, поскольку среди патогенных для человека аспорогенных анаэробов встречаются требовательные к питательным субстратам бактерии (бактероиды, фузобактерии).

Специальных отечественных сухих анаэробных сред производственного изготовления, предназначенных для централизованного снабжения бактериологических лабораторий, осуществляющих микробиологическую диагностику анаэробной неклостридиальной инфекции, пока нет.

Зарубежным аналогом и возможным субстратом противопоставления может служить сложная по составу сухая анаэробная среда фирмы Oxoid под названием Wilkins Chalgren anaerobe agar, состоящая из триптона, желатинового пептона, дрожжевого экстракта, декстрозы, аргинина, пирувата натрия, менадиона, гемина, хлорида натрия, агара, обогащаемая дополнительно перед употреблением кровью.

Основным недостатком данной среды, как и всех прочих кровяных анаэробных сред лабораторного приготовления, является не только обременительное для лабораторий манипулирование со стерильной кровью, но главным образом, их непрозрачность, исключающая возможность применения технически простого и очень экономного анаэробного культивирования посевов исследуемого материала по методу Виньяль-Вейона (в запаянных с двух концов стеклянных трубках) и вынуждающая прибегать к чашечным посевам с последующим культивированием либо в малодоступных зарубежных специальных анаэростатных системах разового пользования, либо в обычных анаэростатах, для чего необходимы вакуумные насосы, многокомпонентные газовые смеси.

Прототипом может служить не требующая обогащения нативной кровью прозрачная, термостабильная среда лабораторного приготовления, представленная питательным глюкозным индикааторным агаром с добавлением специально разработанного авторами данной заявки и запатентованного стимулятора роста аспорогенных анаэробных бактерий.

Установленная возможность приготовления такого анаэробного стимулятора в сухом виде создает условия для приготовления сухой анаэробной оптимальной, прозрачной, термостабильной, индикаторной среды.

Цель изобретения усовершенствование микробиологической индикации патогенных аспорогенных анаэробных бактерий на основе разработки нового технологичного сухого питательного субстрата для централизованного снабжения диагностических бактериологических лабораторий.

Сущность изобретения заключается в последовательном приготовлении закваски в виде суточного микробного перевара 0,5%-ного пептонного молока после внесения навески почвы, содержащей протеолитичного перфрингенс-микроба; приготовлении суточного микробного гидролизата пептонно-кровяного молока (12% цитратной крови) после добавления к нему закваски в объемном соотношении 1: 50 инкубирования при 30^оС до типичного свертывания и переваривания, кипячения, отделения жидкой фазы, просветления ее центрифугированием и стерилизации в автоклаве при 0,5 атм, в течение 30 мин, приготовлении сухого анаэробного стимулятора путем вакуумного упаривания гидролизата пептонно-кровяного молока до 1/10 первоначального объема, добавления к нему в расчете на первоначальный объем по 1 мас. глюкозы, лактозы, растворимого крахмала, 3 мас. сухой питательной среды для контроля стерильности Московского НИИВС, 0,35 мас. хлористого натрия, перемешивания, высушивания в вакуумной сушилке и растирания в порошок; приготовлении целевого продукта путем тщательного перемешивания ингредиентов, представленных 15 мас. сухого анаэробного стимулятора, 47 мас. сухого глюкозного питательного агара с индикатором бромкрезоловым пурпуровым Махачкалинского НИИ питательных сред, 28 мас. пептона и 10 мас. порошкового агар-агара, расфасовки во флаконы из темного стекла с герметической крышкой.

П р и м е р. Впрок заготавливают пептонное молоко. Для этого к 1,8 л обезжиренного путем кипячения, охлаждения и снятия жировой пленки молока добавляют 9,0 г пептона и подогревают до растворения. Пептонное молоко в объеме 1,6 л заливают в двухлитровую колбу, 150 мл во флакон и по 15 мл в три пробирки, после чего все стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. в течение 30 мин. Поскольку для последующего приготовления гидролизатов используют непосредственно почвенную микрофлору, в составе которой обязательно присутствие протеолитичной перфрингенс-культуры, постольку для отбора доброкачественного почвенного образца в три пробирки с пептонным молоком раздельно вносят по 0,5 г почвы, взятой из разных мест с глубины 1-2 см от поверхности. Посевы выдерживают при 30^оС в течение 18-24 ч. Доброкачественный образец почвы, могущий в дальнейшем сохраняться в холодильнике, отбирают по степени гидролизной активности, то есть по показателю типичного свертывания и переваривания пептонного молока (часть пористого свертка казеина подброшена к пробке пробирки, а основная масса представлена мутноватым гидролизатом с почвенным осадком на дне). Для приготовления закваски 5,0 г доброкачественного образца почвы вносят во флакон со 150 мл пептонного молока, перемешивают и выдерживают сутки при 30^оС до типичного свертывания и переваривания. Перед применением закваски в колбу с 1,6 л пептонного молока добавляют 192 мл (12% ) цитратной крови животных и перемешивают.

Закваску в виде молочного гидролизата добавляют к кровяному пептонному молоку в объемном соотношении 1:50 (32 мл). Гидролиз ведут при 30^оС в течение 20-24 ч, после чего приподнятый пористый сверток казеина и фибрина отделяют от стенок колбы и погружают в перевар, содержимое кипятят в водяной бане 45 мин для коагуляции непереваренных белковых субстанций, гидролизат отделяют от остатка путем отжатия через полотно или три слоя марли, просветляют центрифугированием, устанавливают рН 7,2-7,4 и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 30 мин. Выход микробного гидролизата кровяного пептонного молока как промежуточного технологического продукта соответствует приблизительно 1100 мл.

Для приготовления сухого анаэробного стимулятора полученный гидролизат концентрируют упариванием под вакуумом до 1/10 первоначального объема, переливают в ступку, добавляют в расчете на его первоначальный объем по 1 мас. глюкозы, лактозы и растворимого крахмала, 3 мас. сухой среды для контроля стерильности Московского НИИВС и 0,35 мас. хлористого натрия, перемешивают, распределяют массу дополнительно по 3-4 ступкам, высушивают при 65-70^оС в вакуумной сушилке, растирают в порошок, который упаковывают в сухой флакон с герметической крышкой (препарат гигроскопичен). Выход сухого анаэробного стимулятора соответствует приблизительно 105 г. Для приготовления сухой оптимальной индикаторной питательной анаэробной среды как целевого продукта в лабораторной шаровой мельнице тщательно перемешивают смесь ингредиентов, представленных 15 мас. сухого анаэробного стимулятора, 47 мас. сухого глюкозного питательного агара с индикатором бромкрезоловым пурпуровым Махачкалинского НИИ питательных сред, 28 мас. пептона, 10 мас. порошкового агар-агара, готовую среду упаковывают во флаконы из темного стекла с герметической крышкой (препарат гигроскопичен и чувствителен к воздействию прямого солнечного света), хранят в сухом прохладном месте. Выход целевого продукта, приготовленного по описанной методике, соответствует приблизительно 700 г, что достаточно для воспроизводства приблизительно 876 анаэробных бактериологических анализов с применением чашечных посевов исследуемого материала и культивирования в анаэростатах или 5475 анализов по методу Виньяль-Вейона. Навеска целевого продукта в процессе приготовления среды в лабораториях равняется 32 г на 1 л дистиллированной воды (3,2 г на 100 мл). Подготовленная к использованию среда имеет фиолетовый цвет, а при развитии на ней аспорогенных анаэробов желтый. Срок годности целевого продукта при условии правильного хранения 2 года (срок наблюдения).

Доброкачественность целевого продукта контролируется по показателю вполне удовлетворительного развития на приготовленной из него среде в течение первых трех суток при посеве по методу Виньяль-Вейона культуры лабораторного штамма бактероида (наиболее трудно культивируемая анаэробная аспорогенная бактерия). Систематическое использование для контроля качества каждой серии целевого продукта аспорогенных анаэробных бактерий других родов (пептококков, пептострептококков, вейллонелл, фузобактерий, пропионибактерий), не столь зависимых от присутствия в субстрате стимулятора не обязательно.

Эффективность целевого продукта подтверждена путем лабораторного определения индекса эффективности, за который условно принималось отношение подсчитанного в трех полях зрения малого увеличения микроскопа среднего количества колоний бактероидов, развившихся в глубине предлагаемой среды при культивировании по методу Виньяль-Вейона, к количеству колоний, развившихся при всех равных условиях посева и культивирования в среде противопоставления, представленной упомянутым ранее анаэробным агаром фирмы Oxoid с добавлением 5% гемолизированной крови. При этом индекс больше единицы свидетельствовал о превосходстве целевого продукта, а меньше единицы о превосходстве среды противопоставления.

Результаты определения индекса эффективности целевого продукта при пятикратном повторении опытов представлены в таблице.

Как видно, по эффективности целевой продукт не уступает субстрату противопоставления. Целевой продукт технологичен, отличается высокой стандартностью при воспроизводстве, имеет сравнительно низкую себестоимость.

Использование: медицинская микробиология, диагностика анаэробной неклостридиальной инфекции, питательная среда. Сущность изобретения заключается в приготовлении сухой оптимальной индикаторной питательной среды для обнаружения патогенных анаэробных неспорообразующих бактерий путем смешивания следующих ингредиентов: 15 мас. сухого анаэробного стимулятора, 47 мас. сухого глюкозного питательного агара с индикатором бромкрезоловым пурпуровым, 28 мас. пептона и 10 мас. порошкового агар-агара. Хранят среду в сухом прохладном месте. Срок годности среды при условии правильного хранения 2 года. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДИКАТОРНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ АНАЭРОБНЫХ НЕСПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ путем смешивания 15 мас. стимулятора роста труднокультивируемых анаэробных аспорогенных бактерий с глюкозным индикаторным питательным агаром, отличающийся тем, что берут глюкозный агар с бромкрезоловым пурпуровым индикатором в количестве 47 мас. к полученной смеси дополнительно добавляют пептон и порошковый агар-агар в количестве 28 и 10 мас. соответственно, при этом все компоненты используют в сухом виде.