Способ приготовления стимулятора роста трудно культивируемых анаэробных аспорогенных бактерий Советский патент 1992 года по МПК C12N1/38 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается организации рациональной микробиологической диагностики анаэробной неклостридиаль- ной инфекции.

В качестве аналога фигурирует натив- ная кровь как почти незаменимый стимулятор роста труднокультивируемых аспорогенных анаэробных патогенных бактерий в составе и без того сложных питательных сред.

Прототипом может служить молоко с добавлением перед стерилизацией цельной крови.

Существенным недостатком кровяных сред, кроме термолабильности, является их непрозрачность, закрывающая возможность регистрировать рост анаэробных бактерий в толще питательного субстрата при технически простом и экономном культивировании по методу Виньяль-Вейона и побуждающая прибегать к чашечным посевам исследуемого материала на пластинчатые среды с последующим трудоемким культивированием в анаэростатах, для чего требуются еще вакуумные насосы и заместительные многокомпонентные газовые смеси.

Цель изобретения - повышение ростовых свойств, термостабильности и прозрачности целевого продукта.

Сущность изобретения заключается в приготовлении закваски в виде суточного микробного перевара 0,5% пептонного молока после внесения навески почвы, содержащей перфрингенс-бацилла. добавлении закваски в объемном соотношении 1:50 к пептонно-кровяному молоку (молоко с 0,5 мас.% пептона и 12% цитратной крови), инкубировании смеси до типичного свертывания и переваривания,кипячении,отделении жидкой фазы, добавлении в нее глюкозы, лактозы, растворимого крахмала в количестве 1 и 3 мас.% сухой питательной среды для контроля стерильности МНИИВС стерилизации.

Пример. Впрок заготавливают пеп- тонное молоко. Для этого к прокипяченному снятому (обезжиренному) молоку добавляют 0,5 мас.% пептона, смесь нагревают до его растворения, разливают мерно в высокие флаконы с ватной пробкой, а также в несколько пробирок высоким столбиком, после чего стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 30 мин.

Поскольку для последующего приготовления суточного гидролизата кровяного молока используют непосредстеенно почвенную микрофлору, в составе которой обязательно присутствие протеолитичной перфрингенс-культуры, поскольку для контроля доброкачественности почвенного образца в качестве первой технологической операции прибегают к получению почвенной закваски.

С этой целью в серию с пептоиным молоком раздельно вносят бактериологической лопаточкой по 0,5-1 г разных образцов почвы, взятой с глубиной 1-2 см от поверхности (по опыту обычно бывает достаточно трех образцов).

Посевы выдерживают при 30°С в течение 18-24 ч.

В качестве закваски используют содержимое только той пробирки, где произошло типичное свертывание и переваривание пептонного молока (часть пористого свертка казеина подброшена к пробке пробирки, а основная масса представлена мутноватым гидролизатом с почвенным осадком на дне).

Удобно для приготовления закваски пользоваться предварительно отобранным заведомо доброкачественным образцом почвы, сохраняемым в холодильнике.

Перед применением закваски в потребное количество флаконов со стерильным пептонным молоком добавляют по 12% цит- ратной крови животных или донорской крови людей с просроченным сроком годности и перемешивают.

Закваску в виде молочного гидролизата (надосадочной жидкости) добавляют к кровяному пептонному,молоку в объемном соотношении 1::50. Гидролиз ведут при 30°С в течение 20-24 ч, после чего приподнятый к пробке флакона пористый сверток казеина и фибрина отделяют от стенок сосуда и погружают в перевар, содержимое кипятят в .водяной бане 45 мин для коагуляции неперевариваемых частиц (белковых продуктов), гидролизат отделяют от остатка и просветляют центрифугированием или фильтрованием через бумажный фильтр.

Желаемое качество продукта гарантируется только при 12%-ном содержании крови в пептонном молоке, поскольку при избытке крови процесс гидролиза подавляется, а при заниженной дозе - перевар бы0 вает обедненным кровяными ростовыми веществами.

На заключительном этапе приготовления стимулятора к приготовленному микробному перевару добавляют по 1 мас.%

5 глюкозы, лактозы, растворимого крахмала и 3 мас.% порошка сухой среды для контроля стерильности, выпускаемой московским НИИВС, смесь нагревают в водяной бане при помешивании до полного растворе0 ния привнесенных ингредиентов, устанавливают рН 7,2-7,4 и после расфасовки стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 30 мин,

Готовый целевой продукт представляет

5 собой коричневатую прозрачную или слегка опалесцирующую жидкость.

Доброкачественность целевого продукта контролируется микробиологическим методом, а именно, путем параллельного

0 посева при всех равных условиях по способу Виньяль-Вейопа лабораторного штамма бактероида (труднокультивируемая грамот- рицательная аспорогенная облигатно анаэробная бактерия) на обычный глюкозный

5 индикаторный агар и такой же агар, содержащий 10% приготовленного стимулятора, Критерий доброкачественности целевого продукта - отсутствие или очень скудный рост тест-культуры на первой среде и появление

0 обильного роста не позже трех суток - на пторой.

Целевой продукт способен при добавлении в количестве 10-15% к глюкозному индикаторному питательному агару придать

5 последнему свойства оптимальной среды для выделения из исследуемого материала всех патогенных аспорогенных анаэробов, в том числе и по технически простому, экономному методу Виньяль-Вейона.

0

Формула изобретения Способ приготовления стимулятора роста труднокультивируемых анаэробных ас- порогепных бактерий, включающий

5 использование крови, от л и чающийся тем, что, с целью повышения ростовых свойств, термостабильности и прозрачности целевого продукта, в 0.5%-ное пептон- ное молоко вносят навеску почпы, смесь инкубируют в течение 18-24 ч до типичного

свертывания и переваривания, полученныйдо типичного свертывания и переваривания

гидролизат используют в качестве закваскиее, затем кипятят, отделяют жидкую фазу,

пептонно-кровяного молока, представляю-добавляют в нее глюкозу, лактозу, крахмал

щего смесь пептонного молока и 12%-нойв количестве 1 мас.% каждого и 3 мас.%

цитратной крови, при этом закваску вносят5 сухой питательной среды для контроля стев объемном соотношении 1:50, затем пол-рильности МНИИВС и подвергают стерилиученную смесь инкубируют в течение сутокзации.

Область использования: медицинская микробиология, культивирование анаэробов, микробиологическая диагностика. Сущность изобретения готовят суточный по- чвенно-микробный перевар (гидролизат) пептонного молока Используют его в качестве закваски пептоно-кровяного молока, включающего снятое молоко с 0,5% пептона, 0,5% хлористого натрия, 12% цитратной крови. Смесь инкубируют в течение суток до типичного свертывания и переваривания. К полученному гидролизату добавляют 1 мас.% глюкозы, 1 мае % лактозы, 1 мас.% растворимого крахмала, 3 мае % сухой среды для контроля стерильности Московского ИИИВС им. И И.Мечникова. Стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 30 мин. Стимулятор микробного роста применяют в комбинации с обычными плотными питательными средами в соотношении 1:10. сл С