ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБОВ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении первичной питательной среды для культивирования и выделения анаэробов в клинико-диагностической лаборатории.

Для культивирования анаэробных бактерий используют среду Вилкинса-Чалгрена, включающую панкреализаты казеина и желатина, дрожжевой экстракт, глюкозу, хлористый натрий, l-агринин, пируват натрия, агар, гемин, витамин K1 и дистиллированную воду [1] среду Клаузена, содержащую триптон, дрожжевой экстракт, соевый пептон, глюкозу, хлориды натрия, кальция и магния, динатрийфосфат, цитрат, дитионат и бифосфат натрия, l-цистин, l-аспарагин, лецитин, сульфаты магния, кобальта, железа и цинка, твин-80, агар и дистиллированную воду [2]
Однако данные среды содержат дефицитные и дорогие ингредиенты.

Известно также использование для культивирования анаэробов среды Шадлера [3] содержащей панкреализат сои, пептон, дрожжевой экстракт (в качестве источника витаминов группы B), глюкозу, цистеин, гемин, агар, трис-буфер и дистиллированную воду при следующих соотношениях ингредиентов, г/л:
Панкреализат сои 10,0
Ппептон 5,0
Дрожжевой экстракт 5,0
Глюкоза 5,0
Цистеин 0,4
Гемин 0,01
Агар 13,5
Трис-буфер 0,75
Дистиллированная вода Остальное
При использовании этой среды в нее дополнительно ex tempore стерильно вносят 10 мкг/мл менадиона (витамина K1) и 5 об. крови (Каталог фирмы Oxoid, Великобритания, 1991; Morello G.A. Graves M.H. Clinical Anaerobik Bacteriology. -Laboratory Management, 1977, 15, 4, 20-21, 24-25, 51), что и является ее недостатком. Кроме того, на данной среде имеет место низкий рост некоторых видов анаэробов (B.fragilis, B.thetaiotamicron и др.).

Целью изобретения является повышение удобства использования среды.

Указанная цель достигается тем, что питательная среда для культивирования анаэробов, включая глюкозу, цистеин, гемин, менадион, агар, источник витаминов группы B на основе дрожжей и дистиллированную воду, дополнительно содержит триптический и пептический гидролизаты казеина, аминопептид, дигидрофосфат и гидрофосфат калия, сульфаты аммония и магния, хлорид, пируват, сукцинат и карбонат натрия, крахмал, мальтозу, арабинозу, фруктозу и полиглюкин при следующих соотношениях ингредиентов,г/л:
Глюкоза 1±0,5
Цистеин 2±1
Гемин 0,2±0,1
Менадион 0,001±0,0005
Агар 11±2
Источник витаминов группы B на основе дрожжей 9±4
Триптический гидролизат казеина (ТГК) 15±3
Пептический гидролизат казеина (ПГК) 8±3
Аминопептид 3±1
Дигидрофосфат калия 0,5±0,2
Гидрофосфат калия 0,5±0,2
Сульфат аммония 0,5±0,2
Сульфат магния 0,2±0,1
Хлорид натрия 0,8±0,3
Пируват натрия 1,5±0,5
Сукцинат натрия 1,2±0,2
Карбонат натрия 2,3±0,4
Крахмал 1±0,5
Мальтоза 1±0,5
Арабиноза 1±0,5
Фруктоза 1±0,5
Полиглюкин 5±1
дистиллированная вода остальное.

В качестве источника витаминов группы B на основе дрожжей может использоваться экстракт кормовых дрожжей (ЭКД), как в прототипе, либо триптический гидролизат кормовых дрожжей (ТГКД).

В предлагаемой прописи принципиально одновременное использование триптического и пептического гидролизатов казеина. В противном случае имеет место низкий рост микробных культур анаэробов, что происходит, по-видимому, из-за различного аминокислотного состава этих гидролизатов и поясняется данными табл.1.

В табл.1 проиллюстрирована также неприемлемость использования кислотного гидролизата казеина.

Содержание аминного азота в сухих гидролизатах казеина, мас.

Кислотном 3,0
Триптическом 3,2
Пептическом 1,5
Посевная доза 1 млн./мл. Содержание остальных ингредиентов среды равно номинальным значениям, указанным на с.2. Микробные культуры выращивают в анаэростате в газовой среде азота (80%), водорода (10%) и углекислого газа (10%) в течение двух суток при 37^oC.

Способ получения гидролизата казеина влияет также на морфологию микробных колоний. При использовании смеси триптического и пептического гидролизатов колонии находятся в S-форме, тогда как при использовании кислотного гидролизата 60-70% колоний имеют R-форму.

Пример 1. Готовят пять вариантов питательной среды путем смешивания в шаровой мельнице следующих сухих ингредиентов: пептического и триптического гидролизатов казеина (с вышеуказанным содержанием аминного азота), экстракта кормовых дрожжей, аминопептида, дигидрофосфата и гидрофосфата калия, сульфатов аммония и магния, пирувата, сукцината и хлорида натрия, глюкозы, крахмала, мальтозы, арабинозы, фруктозы, цистеина, полиглюкина, гемина, менадиона и агара с последующим растворением в дистиллированной воде. Ингредиенты смешивают из расчета получения вариантов среды, указанных в табл.2. Среды стерилизуют автоклавированием при 121^oC в течение 15 мин.

На данные среды, разлитые в чашки Петри, засевают по 0,1 мл анаэробных культур с концентрацией микробных клеток 0,1 млн./мл. Микробные культуры выращивают анаэростате в газовой среде азота (80%), водорода (10%) и углекислого газа (10%) в течение двух суток при 37^oC. Для каждой культуры используют по три чашки Петри. Выросшие культуры окрашивают по Граму и микроскопируют.

Результаты культивирования приведены в табл.3.

Как видно из данных табл.3, интенсивный рост колоний имеет место только при заявленном диапазоне концентраций ингредиентов питательной среды (среды NN 2-4), тогда как при запредельных концентрациях (среды NN 1 и 5) количество выросших колоний существенно меньше.

Пример 2. Предлагаемую среду готовят, как в примере 1, при номинальном значении концентраций ингредиентов (указаны на с.2). В качестве источника витаминов группы B здесь используют триптический гидролизат кормовых дрожжей (ТГКД).

Посевной материал засевают в чашки Петри с приготовленной средой и средой Шадлера (контроль), используя по три чашки на каждую культуру. Концентрации ингредиентов в прототипной среде Шадлера, в том числе добавляемых ex tempore крови и менадиона, указаны на с.1. На чашки засевают анаэробные культуры в низких дозах: 1 тыс. кл. для B. fragilis и Cl. perfringens, 100 тыс. кл. для B. asaccharalyticus и 10 тыс. кл. для остальных микробов. Условия культивирования как в примере 1.

Результаты выращивания приведены в табл.4.

Как видно из данных табл.4, предлагаемая питательная среда обеспечивает большой выход колоний по сравнению с прототипом (за исключением пептострептококка). Повышение выхода колоний статистически значимо по методу парных сравнений при p=0,05.

Другим преимуществом предлагаемой среды является отсутствие в ее рецептуре дефицитного компонента крови. Кроме того, обеспечена возможность заблаговременного приготовления среды, тогда как в прототипе кровь и менадион вносят ex tempore.

К преимуществу предлагаемой среды относится также расширение источников используемого для ее приготовления непищевого сырья.

Указанные виды положительного эффекта обеспечивают удобство использования предлагаемой питательной среды.

Использование: питательная среда, культивирование анаэробов, биотехнология. Сущность изобретения: среда включает глюкозу, цистеин, гемин, менадион, агар, источник витаминов группы B на основе дрожжей, триптический и пептический гидролизаты казеина, аминопептид, дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат аммония, сульфат магния, хлорид натрия, пируват натрия, сукцинат натрия, карбонат натрия, крахмал, мальтозу, арабинозу, фруктозу, полиглюкин и дистиллированную воду при определенных соотношениях ингредиентов. Предлагаемая питательная среда обеспечивает большой выход колоний. Другим преимуществом является отсутствие в рецептуре среды вносимых extempore дефицитных компонентов, что повышает удобства использования среды. 4 табл.

Питательная среда для культивирования анаэробов, включающая глюкозу, цистеин, гемин, менадион, агар, источник витаминов группы В на основе дрожжей и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит триптический и пептический гидролизаты казеина, аминопептид, дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат аммония, сульфат магния, хлорид натрия, пируват натрия, сукцинат натрия, карбонат натрия, крахмал, мальтозу, арабинозу, фруктозу и полиглюкин при следующих соотношениях ингредиентов, г/л:
Глюкоза 0,5-1,5
Триптический гидролизат казеина 12-18
Цистеин 1-3
Гемин 0,1-0,3
Менадион 0,0005-0,0015
Агар 9-13
Источник витаминов группы В на основе дрожжей 5-15
Пептический гидролизат казеина 5-11
Аминопептид 2-4
Дигидрофосфат калия 0,3-0,7
Гидрофосфат калия 0,3-0,7
Сульфат аммония 0,3-0,7
Сульфат магния 0,1-0,3
Хлорид натрия 0,5-0,11
Пируват натрия 1-2
Сукцинат натрия 1-1,4
Карбонат натрия 1,9-2,7
Крахмал 0,5-1,5
Мальтоза 0,5-1,5
Арабиноза 0,5-1,5
Фруктоза 0,5-1,5
Полиглюкин 4-6
Дистиллированная вода До 1 л5