Способ получения бычьего,свиного или человеческого проинсулина Советский патент 1987 года по МПК C07K14/62 A61K38/28 

1

Изобретение относится к способу получения бычьего, свиного или человеческого проинсулина - биологически активного соединения, применяемого в биологии и медицине.

Цель изобретения - упрощение процесса.

Получение исходных продуктов.

Линейный цепной S-сульфонатный предшественник инсулина.

К I00 мл охлажденной деионизиро- ванной 7М мочевины добавляют 786 мг сульфита натрия, раствор перемешивают, добавляют 594 мг тетратионата натрия, перемешивание продолжают, однако раствор остается мутным. Устанавливают рН 7,7 ледяной уксусной кислотой. При перемешивании добавляют очищенный с помощью HPZC бычий проинсулин (503 мг). Устанавливают рН реакционного раствора 7,6 2н. гидроокисью натрия. Полученный мутноватый раствор перемешивают при 6°С в течение 18ч.

Приблизительно половину реакционной смеси отделяют, устанавливают рН 9,1 с помощью 2н. гидроокиси натрия, и вводят в колонку с сефадексом Ж-25 (грубый).

Условия хроматографир ования: растворитель - 0,05М бикарбонат аммония; рН 9,0; размеры колонки 2x90 см; температура 21 С; скорость.потока 18,5 мл/мин.

Первые 120 мл вытекающей жидкости сливают, а следующие 75 мп собирают. Затем колонку промывают другой порцией 0,05М бикарбоната аммония при рН 9,0 (АОО мл). Эту процедуру повторяют для второй половины реакционного раствора. УФ-спектры двух пулов показывают, что получено всего 401 мг Пулы объединяют и лиофилизируют досуха. Получают 445,7 мг сухого обессоленного продукта. Строение полученного продукта - линейного цепного S-сульфонатного бычьего проинсулина и отсутствие исходного материала подтверждено электрофорезом на ацетате целлюлозы и полиамидным дисковым гель-электрофорезом.

Линейный цепной S-сульфонатный бычий проинсулин чистят хроматографией на ДЕАЕ-целлкшозе. Неочищенный образец (443 мг) растворяют в 10 мп смеси 7,5М мочевина - 0,0Ш Трис - 0,001М ЕДТА при рН 8,5 и вводят в колонку с ДЕАЕ-целлюлозой.

013192

Условия хроматографирования: растворитель - 7,5М мочевина - 0, Трис - 0,001М ЕДТА, рН 8,5 с градиентом 0-0,35М хлористого натрия; раз- 5 меры колонки 2,5x90 см; температура 4°С, скорость потока около 0,9 мл/мин; объем фракций 5,3 мл.

Поглощение при 276 нм для каждой фракции, построенное в зависимости JO от номера фракции, указывает на большой пик с небольшим хвостом, УФ- спектроскопия показала, что большой пик и есть получаемый продукт, фракции 199-240 с объемом вытекшей фазы 15 1069-1291 мл объединяют. УФ-спектр для этого образца соответствует 355 мг.

Полученный пул обессоливают на колонке с сефадексом Ж-25 (грубый). 20 Условия хроматографирования:

растворитель - 0,05М бикарбонат аммония; рН 8,0; размер колонки 3,7х х105 см, температура 4°С; скорость

25

потока 16,0 мл/мин.

Первые 396 мл жидкости сливают, а следующие 250 мл собирают и сохраняют. Затем колонку промывают другой порцией 2000 мп 0,05М бикарбона30 та аммония с рН 8,0.

УФ-спектр этого пула показал 321 мг этого образца. Образец лиофилизируют досуха. Собирают 373 мг сухого материала. Идентичность продук35 та подтверждается полиакриламидным дисковым гель-электрофорезом и высокоэффективной жидкостной хроматографией низкого давления HPZPZC на основании времени элюирования.

40 В следуюш;их примерах описано получение бычьего, свиного или человеческого проинсулина.

Пример 1. Концентрация 0,1 мг/мл.

45 К раствору 1,61 мг линейного цепного S-сульфонатного бычьего проинсулина в 16,1 мл дегазированного 0,05М глицина (рН 9,5) добавляют 0,158 мл водного 2-меркаптоэтанольного раст50 вора, который при титровании реагентом Эллмана показал содержание меркаптана 2,11 мг/мл, что соответствует 4 экв. 2-меркаптоэтанола на - SSO - в линейном цепном З-сульфо55 натном бычьем проинсулине. Окончательное значение рН 9,46. Раствор, приготовленный при комнатной температуре, запаивают парафином, а затем перемешивают при охлаждении до 6 С в течение 19 ч.

Затем реакционную смесь подкисляют до рН 4,0±0,1 (терморегулировка), используя концентрированную соляную кислоту и 0,5 н. гидроокись натрия. Выделяют продукт. Строение подтверждено высокоэффективной жидкост ной хроматографией низкого давления (HPZPZC).

Условия HPZPZC следующие: колон- ка 1,1x54 см, стеклянная колонка, заполненная ЛП-1/С, с содержанием С 16,6%; растворитель - 30% ацето- нитрила и 70% формиата аммония, рН 4,25; температура 21 С; давление 8028 скорость потока 2,40 мл/мин.

Образец вводят в колонку с помощью 5 ип пробного петлеобразного инжектора и работают на длине волны 280 нм.

Первый введенный образец представлял собой 5 мл раствора бычьего про- инсулина с номинальной концентрацией протеина 0,1 мг/мл; второй введенный образец - 5 мл подкисленной реакционной смеси. Наличие мономерного бычьего проинсулина в реакционной смес подтверждено на основании времени элюирования. Расчет площадей пиков двух циклов HPZPZC показал, что выход бычьего проинсулина в реакционной смеси составил 82,6%.

Результаты исследований представлены в табл. 1.

Таблица 1

Asp thr Ser Glu Tro Gly Ala

Продолжение табл.1

10

15

20

30

25 Остаточные значения являются среними по трем определениям (30 ч гидролиза) , Ala 1,0.

Пример 2. Концентрация 0,5 мл/мг,

К раствору 25,07 мг линейного цепного S-сульфонатного бычье.го проинсулина в 50,14 мл дегазированного 0,05М глицина, рН 10,51, добавляют 1,302 мл водного 2-меркаптоэтаноль- ного раствора, который при титровании реагентом Эллмана имеет концентрацию меркаптана 2,10 мг/мл, что соответствует 2,1 экв. 2-меркапто- этанола на - SSO - в линейном цеп- 40 ном S-сульфонатном бычьем проинсу- лине. Окончательное рН 10,47. Раствор , приготовленный при комнатной температуре, запаивают парафином и затем перемешивают при охлаждении 45 ДО 6 С в течение 18 ч.

Реакционную смесь подкисляют до рН 4,010,1 (терморегулировка), используя концентрированную соляную кислоту и 0,1н. соляную кислоту. Анализ с помощью HPZPZC пркгазал 69%-ный выход бычьего проинсулина в реакционной смеси.

Полученный продукт после обессо- ливаьшя выделяют с помощью гель- J5 фильтрунщей хроматографии. Устанав- - ливают рН реакционной смеси 9,0 концентрированной гидроокисью аммония и вводят в колонку, заполненную сефа- дексом Ж-25.

50

5.

Условия хроматографического обес- соливания: растворитель - 0,05М бикарбонат аммония, рН 9,0; размеры колонки 2x90 см; температура 21°С; скорость потока 18,5 мп/мин.

Первые 120 мп полученной жидкости сливают, следующие 75 собирают (протеиновый пул). Затем колонку промывают другой порцией 400 мл 0,05М бикарбоната аммония с рН 9,0,

УФ-спектр протеинового пула показал, что вьщелено 21,6 мг протеина. Этот пул лиофилизируют hocyxa. Получают 22,21 мг сухого обессоленно- го протеина.

Часть этого материала (14,94 мг) растворяют в 5,5 мп 1,ОМ уксусной кислоты,

УФ-спектр прозрачного раствора показал, что концентрация протеина составила 2,56 мг/мл. 5 мл этого раствора (12,8 мл по данным УФ) вводят в колонку ;С сефадексом Ж-50 (сверхтонкий),

Условия хроматографирования: растворитель - IM уксусная кислота; размеры колонки 1,5x100 см температура 21°С; скорость потока 0,19 мл/мин объем фракций около 1,9 мл.

По мере элюирования в течение ночи IM уксусной кислоты записывают поглощение на длине 280 нм. На полученной кривой - два пика. Первый, меньший, пик соответствует агрегат-, ным формам бычьего проинсулина; второй пик - мономерному бычьему инсулину. Пулы собирают для двух пиков. Полученные фракции объединяют,

Пул I: фракции 30-46 (55,0-84,0 м пик 70,4 мл),

Пул II: фракции 47-62 (84,0 - 112,0 мл; пик 99,8 мп).

По данным УФ-спектров в пуле I содержится 1,94 мг, в пуле II - 10,и т,е, всего 12,05 мг (выход 94,1% от количества, введенного в колонку), Всего выделяют 83,9% мономерного бы- чьего инсулина.

Оба пула лиофилизируют досуха. пула I идентифицирован как бычий| проинсулин на основании времё- Ии элюирования в цикле HPZPZC, что также подтверждено с помощью обработки трипсином и карбоксипептида- зой В (табл. 2),

6

Таб лица 2

Пример 3. Влияние температуры.

Процедуру примера 1 использовали для определения влияния температуры на выход бычьего инсулина из линейного цепного S-сульфонатного бычьего проинсулина.

Условия реакции: концентрация ; протеина 0,1 мл/мг; буфер - 0,05М глицин; рН 9,5; меркаптан - 2-мер- каптоэтанол в количестве, обеспечивающем 4 экв. - SH на - SSOj-; время 18 ч.

Проведение реакции при 21°С обеспечивает выход проинсулина 47% по

71

данным HPZPZC, В случае, если реагенты смешивают при 21°С, а затем процесс проводит при охлаждении до 6 С, выход 77%.

Пример 4, Влияние рН.

Процедуру примера 1 используют для определения влияний рН на выход бычьего проинсулина из линейного цепного S-сульфонатного бычьего проинсулина в ряде реакций, проводимых одно временно.

Условия реакций: концентрация протеина 0,5 мг/мл; буфер - 0,05М глицин; меркаптан - 2-меркаптоэтанол в количестве, обеспечивающем 2 экв, - SH на - ЗЗОз; время 18ч; температура 6 С.

По данным HPZPZC выход проинсулина следующим образом зависит от рН:

рН Выход, % 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0

Пул I - 22,1

пул III - 103,6 мг, что составляет 154 мг и соответствует выходу 94% от количества, введенного в колонку. Из выделенного количества 63,7% составляет мономерный человеческий проин- сулин. Все три пула замораживают и лиофилизуют досуха.

Из трех пулов собирают 106,55 мг сыхого материала. Иденти4ицируют человеческий проинсулин аминокислотным анализом и полиакриламидным дисковым гель-электрофорезом, а также на основании времени злюирования на рН LC при котором ожидается выход человеческого проинсулина по отношению к проинсулину бычьему. Дальнейшую иден ти(|икацию проводят при обработке трипсином и карбоксипептидазой В до получения человеческого инсулина (табл, 3),

Таблица 3

43,1 44,3 66,7 76,0 61,0 мг; пул II -28,3 мг;

Asp

4,07

4,0

Thr

2., 82

3,0

8 Продолжение табл.3

20

25

30

Остаточные значения являются средними для трех определений (30 ч гидролиза), Ala 1,0,

Пример 5, Влияние концентрации протеина на выход продукта.

Процедуру примера 1 используют для определения влияния концентрации протеина на выход бычьего проинсулина из линейного цепного S-сульфонатного бычьего проинсулина в ря- Де реакций, проводимых одновременно.

Условия реакций: буфер - 0,05М глицин; рН 9,5; меркаптан - 2-меркаптоэтанол в количестве, обеспечи

вающем 4 экв, - SH на - время 18 ч; температура 6°С,

По данным HRZPZC изменение концентрации протеина следующим образом влияет на выход проинсулина:

Концентрация про- Выход, % теина, мг/мл

0,1

78

0,2

63

46

37,6 25,4 42

При проведении другого цикла опытов для 2 экв. - SH на - SSO.J - и при рН 10,5 получают следующие результаты:

Концентрация протеина, мг/мл

0.5

0,96

1,83

4,2

7,4

Выход, %

77,2 58,3 19,5

Г5

По данным HPZPZC тип меркапта следующим образом влияет на выхо проинсулина:

20

Меркаптан

Дитиотреитол

Дитиоэритритол

Выход, 39,3 34,9

20,1 Метилтиогликолят56,1

19,6 З-Меркапто-1,2-пропандиол 65,5

Причем в двух последних случаях отношение SH: - SSOj - 1,2.

Пример 6. Влияние отношения - SH: - SSOg - на выход проинсулина.

Процедуру примера 1 используют для определения влияния отношения - SH.к - SSOj - на выход бычьего проинсулина из линейного цепного S-суль- фонатного бычьего проинсулина в ряде реакций, проводимых одновременно.

Условия реакций: концентрация протеина 0,5 мг/мл;. буфер - 0,05М глицин; рН 9,5; время 18ч; температура .

По данным HPZPZC изменение соотношения - SH: - SSO,- следующим образом влияет на выход проинсулина:

Отношение Выход, %

Пример 7. Влияние типа меркаптана на выход проинсулина.

130131910

Процедуру примера 1 используют для определения влияния строения меркаптана на выход бычьего проин- сулина из линейного цепного S-суль- 5 фонатного бычьего проинсулина в ряде реакций, проводимых одновременно.

Условия реакций: концентрация протеина 0,1 мг/мл; буфер - 0,05М глицин; рН 9,5; меркаптан, 4 экв. - SH на - SSOj-; время 18 ч; температура 6 С,

По данным HPZPZC тип меркаптана следующим образом влияет на выход проинсулина:

Меркаптан

Дитиотреитол

Дитиоэритритол

Выход, % 39,3 34,9

3-Меркаптопропионовая

кислота65,3

2-Меркаптоэтанол64,1

Пример 8. Влияние типа протеина на выход проинсулина.

Процедуру примера 1 используют

для определения влияния типа протеина на выход проинсулина из линейного цепного S-сульфонатного проинсулина в ряде реакций, проводимых одновременно.

Условия реакций: концентрация протеина .0,1 мг/мл; буфер - 0,05М шлицин; рН 9,5; меркаптан - 2-мер- каптоэтанол в количестве, обеспечивающем 4 экв. - SH на - SSOj-; время 18 ч; температура 6 С.

По данным HPZPZC выход проинсулина следующим образом зависит от типа протеина:

Линейный цепной S-сульфонатный проинсулин

Бычий Свиной

, %

60,6 65,8

Пример 9. Получение человеческого инсулина.

К раствору 169,3 мг биосинтетиче- ски полученного линейного цепного S-сульфонатного человеческого проин- сулина в 338,6 мл дегазированного 0,05М глицина (,54) добавляют 7,71 МП водного раствора 2-меркапто- этанола, который при титровании реа- гентом Эллмана показал концентрацию меркаптана 2,08 мг/мл, что соответствует 2 экв. 2-меркаптоэтанола на JQ - SSO - в линейном цепном S-суль- фонатном человеческом проинсулине, С помощью 5н, гидроокиси натрия доводят рН до 10,52. Раствор запаивают парафином и перемешивают при 6 С J5 в течение 18ч.

Затем реакционную смесь подкисля- ют до рН 2,9+0,1 (терморегулировка) концентрированной соляной кислотой. Полученный прозрачный раствор вводят 20 в колонку, заполненную сефадексом Ж-25 (грубый), для обессоливания.

Условия хроматогра мрования: растворитель - 2%-ная уксусная кислота; размеры колонки 5x100 мм; темпера- 25 тура 25°С; скорость потока 28,8 мл/мин; объем фракции 20,2 мл.

Первые 789 мл полученной жидкости сливают, а следующие 464 мп собирают и сохраняют. Определение оптичес- зо кой плотности на 280 нм показало, что это протеиновый пул. Колонку промывают дополнительно 2500 мл 2%-ной уксусной кислоты. Расчеты на основаной форме человеческог второй пик - мономерно кому проинсулину (плеч части), Собирают три п Фракции объединяют.

Пул 1: фракции 46-67 пул II: фракции 68,81 (3 пул III: фракции 82 490,3 мл)..

Для этих пулов по д ров рассчитаны следующ протеина:

пул I - 22,1 мг; пу пул III - 103,6 мг.

Получено 154 мг про ответствует выходу 94% ва, введенного в колон ного количества 67,3% номерный человеческий Все 3 пула замораживаю зируют досуха.

Из трех пулов собир сухого материала.

Аминокислотный анал амидный дисковый гельподтвердили, что получ кий проинсулин. Время ния при HPZC соответст элюирования человеческ на по отношению к бычь ну. Дальнейшую идентиф дят при обработке трип оксипептидазой В (до п

нйи данных УФ-спектра для протеиново-,г ловеческого инсулина).

го пула показали, что выход протеина 164 мг, что соответствует 101,9% количества, введенного в колонку (теоретический выход reformation реакции) . Этот пул замораживают и лиофи- лизируют досуха.

Целевой продукт выделяют, используя гель-(|ильтрационную хроматографию. Сухой продукт (не взвешенный) растворяют в 20 мл Ш уксусной кислоты. Полученный прозрачный раствор вводят в колонку, заполненную сефадексом Ж-50 (сверхтонкий).

Условия хроматографирова1шя: растворитель - 1М уксусная кислота; размеры колонки 2,5x125 см; темпера- тура 25°С; скорость потока 0,82 мл/мин; объем фракций примерно 4,92 мл.

В течение ночи колонку элюировали Ш уксусной кислотой; записывали поглощение при 270 нм. На полученной кривой поглощения на 280 нм от номера фракции получили 2 пика. Первый пик (меньший) соответствует агрегат40

Пример 10. Че проинсулин-цистеин,

К раствору 130 мг ч проинсулин-8-сульфонат лодного дегазированног цина с рН 10,4 прибавл исходного водного раст который имеет содержан 3,63 мг/мл (титрование , Эллмана), что соотве жанию 50 мас.% меркапт рН 10,5 достигают с по ления небольшого колич роокиси натрия. Раство перемешивают при 6 С в

50

55

После этого реакцио подкисляют до рН 3,8 л ной кислотой. По дан1й 1 хроматографии высокого (ЖХВД) выход проинсули 56,3 мас.%. К подкисле онной смеси прибавляют вину и получают конечн цию мочевины, равную 4

ной форме человеческого проинсулина, второй пик - мономерному человеческому проинсулину (плечо передней части), Собирают три пула фракций. Фракции объединяют.

Пул 1: фракции 46-67 (218-325,5 мл); пул II: фракции 68,81 (325 ,6-395,5 мл); пул III: фракции 82-100 (395,5- 490,3 мл)..

Для этих пулов по данным УФ-спект ров рассчитаны следующие количества протеина:

пул I - 22,1 мг; пул II - 28,3 мг пул III - 103,6 мг.

Получено 154 мг продукта, что соответствует выходу 94% от количества, введенного в колонку. Из выделенного количества 67,3% составляет мономерный человеческий проинсулин. Все 3 пула замораживают и лиофили- зируют досуха.

Из трех пулов собирают 106,55 мг сухого материала.

Аминокислотный анализ и полиакрил амидный дисковый гельэлектрофорез подтвердили, что получен человеческий проинсулин. Время его элкирова- ния при HPZC соответствует времени элюирования человеческого проинсулина по отношению к бычьему проинсулину. Дальнейшую идентификацию проводят при обработке трипсином и карб- оксипептидазой В (до получения че0

Пример 10. Человеческий проинсулин-цистеин,

К раствору 130 мг человеческого проинсулин-8-сульфоната в 404 мп холодного дегазированного 0,02М глицина с рН 10,4 прибавляют 13,9 мл исходного водного раствора цистеина, который имеет содержание меркаптана 3,63 мг/мл (титрование с реагентом , Эллмана), что соответствует содержанию 50 мас.% меркаптана в белке. рН 10,5 достигают с помощью прибавления небольшого количества 5н, гидроокиси натрия. Раствор закрывают и перемешивают при 6 С в течение 18ч.

0

5

После этого реакционную смесь подкисляют до рН 3,8 ледяной уксусной кислотой. По дан1й 1м жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) выход проинсулина составляет 56,3 мас.%. К подкисленной реакционной смеси прибавляют твердую мочевину и получают конечную концентрацию мочевины, равную 4М. Проинсулин

13.1

выделяют ионообменной хроматографией на SP-Sephadex, а затем хроматографией на DEAE. После этого полученное очищенное соединение очищают гель-фильтрационной хроматогра- (}ией на Sephadex G 50SF. Полученное соединение является человеческим проинсулином, что подтверждается ЖХВД с одновременным элюированием человеческого проинсулина в качестве сравнения. Выход твердого человеческого проинсулина 43 мас,%. 12 мг человеческого проинсулина отбирают на аналитические цели в ходе описанной фильтрации (если это количест- во включить в результирующий выход, то общий выход проинсулина составит 52 мас.%).

Результаты исследований приведены в табл. 4.

Таблица 4

Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Cys Val Jle Leu Tyr Phe His Lys Yrg

1914

Остаточные значения являются средними для трех определений (30 ч гидролиза) . Ala 1,0.

Предлагаемый способ позволяет непосредственно, в одну стадию, превращать S-сульфонат в целевой дисуль- фидный предшественник инсулина благодаря осуществлению непосредственного обмена в условиях, не требующих присутствия кислорода.

Формула изобретения

1, Способ получения бычьего, свиного или человеческого проинсулина общей формулы 1

(А-1 G19--NH

(А-6) Cys-S-S (А-гО) (/1-21) (А-7) CijsCyS-Ci)S-ASn-OH

S (A-IO S

SS

(B-1 R-WH-Phe-Cys

-Cgs

где R - водород;

Y - Lys-Ala- или -Lys-Thr-; X - Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Gly-Pro- -Gln-Val-Gly-Ala-Leu-Glu- -Ceu-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly- Ala-Gly-Gly-Leu-Glu-Gly-Pro- -Pro-Gln-Lys-Arg; Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro- -Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu- -Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly- -Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala- -Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-GIn- -Lys-Argt

-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp- -Leu-Glu-Val-20Gly-Gln-Val- -Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro- -Gly-Ala-Gly-SerrLeu-Glu- -Pro-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu- -Glu-Gly-Ser-Leu-Glu-Lys- -Arg-,

путем конверсии S-сульфонатных групп

8-сульфонатге)1х полипептидов абщей

формулы II

U-1 GUJ--NH-X

(А-б) Cys-S-Sof S-SO

I1 (А-20 (А-21)

(jySCijS-Ci)S-Asn-OH

S-SO k-SO

tA-7)

3

s-sof

R-HH-Phc-Cys(B-11

f-sdf

(B-7)

-Суз- (BH9)

15

где R, X и Y имеют указанные значения,

в дисульфидные мостиковые группы, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса S-сульфо- натные полипептиды общей формулы II подвергают взаимодействию с меркаптаном, взятом в количестве, обеспечивающем 1,0-4,0 эквивалента SH- фрагмента на каждый SSO -фрагмент в водной среде при рН 9-11, концентрации S-сульфонатного полипептида II

1319

16

fO

0,1-7,4 мг на 1 мл водной среды при .

2. Способ по п. 1, отличающий с я тем, что величину рН реакционной среды поддерживают, добавляя глицин в концентрации 0,05М.

Приоритет по признакам

27,03,80 - бычий, свиной проин- сулин;

28,11,80 - человеческий проин- сулин.

Изобретение касается соединений, родственных пептидам, в частности получения бычьего, свиного или человеческого проинсулина (ПИ), который проявляет биологическую активность и может быть использован в биологии и медицине. Упрощение процесса достигается переводом S-суль- фонатных групп соответствующего исходного пептида в дисульфидные мости ко вые группы с помощью другого, реагента - меркаптана, взятого в количестве, обеспечивающем 1-4 эквивалента S-SH-фрагмента на каждый S-S03-фрагмент.Процесс ведут в водной среде при рН 9-11, концентрации S-сульфонатного полипептида, равной 0,1-7,4 мг/мл водной среды, и температуре 6-21°С. Величину рН реакционной среды поддерживают добавлением 0,05 М раствора глицина. Способ обеспечивает проведение процесса в одну стадию в условиях, не требующих присутствия кислорода. 1 3 . п. ф-лы, 4 т абл. § СУ) : о :о со см