ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ЖИДКАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА ВАКЦИННОГО ШТАММА ЕВ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии, именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования чумного микроба вакцинного штамма ЕВ, и может быть использовано в медицинской микробиологии.

Известна питательная среда для культивирования чумного микроба, для приготовления которой гидролизат говяжьего мяса разводят питьевой водой до содержания аминного азота до 120-140 мг%; поваренной соли 0,3-0,5%; двуосновного фосфорнокислого калия 0,1-0,2%. Проваривают в кастрюлях при температуре (121±1)°С до растворения ингредиентов в течение 2 мин. Устанавливают рН 7,2±0,2. Выращивание чумного микроба вакцинного штамма ЕВ проводят при температуре 27±1°С (Регламент Производства №702-97. Вакцина чумная живая сухая. 2002 г., 260 с.).

Недостатком данной питательной среды является ее недостаточная продуктивность.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является питательная среда для культивирования чумного микроба вакцинного штамма ЕВ, включающая, г/л: в качестве питательной основы ферментативный гидролизат бобов сои - 320-420, натрий хлористый - 4,0-6,0, натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-5,0, натрий сернистокислый 0,3-0,5, липоевую кислоту - 0,4-0,6, 20%-раствор гидроокиси натрия 2,5-3,5 и дистиллированную воду до 1 л. Устанавливают рН 7,2±0,2. Выращивание вакцинного штамма ЕВ проводят при температуре 27±1°С (Патент РФ №2260620. Опубл. 20.09.05. Бюл. №26).

Недостатком данной питательной среды является ее недостаточная продуктивность.

Целью изобретения является получение качественной питательной среды животного происхождения, обеспечивающей выращивание микробных клеток чумного микроба в достаточном количестве при более низкой температуре при - 21±1°С.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат говяжьего мяса со стимулирующими добавками натрия сернистокислого, стимулятора Карпузиди и очищенную воду при следующем содержании ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат   говяжьего мяса 170,0-190,0 Натрий хлористый 3,0-5,0 Натрий сернистокислый 3,0-5,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-5,0 Стимулятор Карпузиди 0,006-0,010 Очищенная вода До 1 л

Натрий сернистокислый ГОСТ 195-77 - хорошо зарекомендовал себя как стимулятор роста чумного микроба. Морфология колоний типична (Микробиология чумы. Издательство Иркутского университета. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. С.-6-9, 1976 г.).

Согласно данным ряда авторов при культивировании чумного микроба на жидких питательных средах требуется не только оптимальное количество кислорода, но и повышенное содержание углекислоты. В настоящее время можно считать бесспорным благоприятное действие кислорода на рост чумного микроба при благоприятном окислительно-восстановительном потенциале, что давно нашло свое применение при культивировании чумного микроба (Коробкова, 1956).

Снижение окислительно-восстановительного потенциала можно достигнуть искусственным путем - введением в среду натрия сернистокислого. Концентрация натрия сернистокислого в пределах от 0,005 до 0,1% оказалась более благоприятной. Указанные концентрации натрия сернистокислого создают оптимальный уровень окислительно-восстановительного потенциала, при рН 7,1-7,2 для начала роста чумного микроба на жидких питательных средах. Так Девинья и Шет (1942), Девинья (1943), Филиппс (1943), Апарин (1989), Самойлова (1998) отмечали увеличение выхода микробных тел при аэрации культур чумного микроба на жидких средах.

Стимулятор Карпузиди выпускается Олайненским заводом химреактивов, его стимулирующее действие проявляется при добавлении 6-10 мг препарата на 1 мл питательной среды. При использовании стимулятора Карпузиди содержимое ампулы растворяют в 10 мл 30° или 40° спирта). (Микробиология чумы. Издательство Иркутского университета. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. С.6-9, 1976 г.).

Сукнев и Вольферц (1932), Желтенков и Анохина (1957), Карпузиди и др. показали, что рост чумного микроба из единичных клеток возможен в присутствии микробов симбионтов, а также продуктов их жизнедеятельности, находящихся в фильтратах бульонных культур.

Известно, что микроорганизмы являются непревзойденными производителями ценных продуктов. С помощью их можно получить полноценный белок, различные липиды, полисахариды и витамины (Возняковская, 1966; Имшенецкий, 1970).

В качестве ростовых веществ для чумного микроба Карпузиди (1950) был предложен и успешно применен лизат сарцин, являющихся, как известно, микробами - «кармилками» для чумного и некоторых других микроорганизмов. Добавление к агару даже 0,1% лизата в качестве стимулятора роста делает среду настолько оптимальной, что рост чумной культуры начинается с самой минимальной посевной дозы - практически с одного микробного тела К.С.Карпузиди и Л.Н.Макаровская (1956).

Сарцинный стимулятор роста представляет собой лиофилизированный препарат приготовленной из лизата желтой сарцины. Препарат впервые предложен в 1950 г. К.С.Карпузиди для стимуляции роста чумного микроба и широко используется в практической работе противочумных учреждений (Карпузиди, 1958), а также рекомендован как стимулятор роста возбудителя дифтерии (Брудный, 1966).

Согласно инструкции срок годности готового стимулятора (сухого) составляет 2 года: после этого рекомендуется проводить переконтроль. По данным Н.Г. Ованесова, Н.Ф. Касаткина (1969) препарат продолжает сохранять свою стимулирующую активность на высоком уровне значительно дольше. Хранение препарата даже в течение 6 лет при комнатной температуре не снижает его способности стимулировать рост чумного микроба. Степень активности сарцинного стимулятора и гемолизированной крови оказались равноценной. Однако на средах, к которым был добавлен стимулятор, колонии чумного микроба имели типичную морфологию с хорошо выраженной кружевной зоной, в то время как на агаре, содержащем гемолизированную кровь, колонии были темно-бурыми, почти лишенные периферической зоны.

В производстве сарцинного стимулятора роста чумного микроба используют лизат микробной массы сарцины, которую выращивают в течение 7 суток на агаре Хоттингера или на других питательных средах, обычно применяемых в лабораторной практике. Для более полного выявления микробных клеток чумного микроба, способных к росту и формированию колоний на твердых питательных средах, Печникова И.В. (1974) использовала агар Хоттингера с добавлением стимулятора Карпузиди, натрия сернистокислого.

Проведенные опыты по отработке температурных режимов культивирования чумного микроба в градиенте 21°С в сравнении с регламентным 27°С показали, что температура выращивания существенно влияет на количество микробных клеток. При этом температура выступает как фактор, влияющий на биосинтетические процессы в цитоплазматических мембранах клеток за счет увеличения содержания ненасыщенных жирных кислот, накопление которых в мембранах клеток способствует их большей устойчивости к лиофилизации (Иванова Г.Ф., Будыка Д.А., Абзаева Н.В. Сборник научных трудов. - Ставрополь, 2007. - С.186-188; Тинкер А.И., Будыка Д.А., Верховцева Г.Н., Печников Е.Н. Актуальные вопросы профилактики особо опасных инфекционных заболеваний. Киров, 1991. - С.38-40).

Очищенная вода - показатели по стандарту ФС 42-2619-97. Бесцветная прозрачная жидкость без запаха и вкуса: удельная электропроводность, мкС/см - не более 0,5; рН 5,0-7,0; восстанавливающие вещества по ФС-2619-97; хлориды, мг/мл - не более 0,0001; сульфиты, мг/мл - не более 0,003; кальций, мг/мл - 0,0035; тяжелые металлы, мг/мл - не более 0,0005; микроорганизмы, ед/мл - не более 100 при отсутствии бактерий семейства Enterobacteriacea, Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.

Соляная кислота ГОСТ - 3118-77, (чда, хч) используется для установления рН. Массовая доля основного вещества, % 35-38.

В отличие от прототипа предлагаемая среда обеспечивает высокую продуктивность микробных клеток (155 млн м.к. через 48 ч) при более низкой температуре 21±1°С.

Методика подсчета количества микробных клеток

Питательные агары из панкреатического перевара мяса (агар Хоттингера для чумного микроба по ФС 42-3204-98), применяемые для определения количества живых микробных клеток, должны обеспечивать без добавления стимуляторов рост микробов вакцинного штамма ЕВ на всех чашках с агаром, засеянных 10 м.к. по ОСО мутности 42-28-85П 10МЕ. В качестве стимулятора роста к питательным средам перед розливом их в чашки Петри добавляют 1 мл/л гемолизированной крови или 0,25 г/л свежеприготовленного прокипяченного натрия сернистокислого. Пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида и пипетки, используемые при определении содержания живых микробов в биомассе, должны быть охлаждены до температуры (4±2)°С. Из каждой пробирки с жидкой питательной средой содержимое в количестве 0,1 мл разводят 0,9% раствором натрия хлорида в количестве 0,9 мл (основное разведение 10^-1). Добавляют последовательно физиологический раствор до получения 1 млрд м.к./мл. Затем пипеткой делают последовательные десятикратные разведения полученной взвеси в 0,9 % растворе натрия хлорида, начиная с 10^-1 (0,5±0,01) мл взвеси с 4,5±0,05 мл 0,9% раствора натрия хлорида и кончая 10^-5. Разведенную биомассу из двух последних пробирок (10^-5) засевают пипеткой по (0,1±0,01) мл на 2 чашки с питательным агаром рН 7,2 и выдерживают при температуре (21±1)°С 2-3 суток.

Приготовление ферментативного гидролизата из говяжьего мяса.

В реактор наливают питьевую воду из расчета имеющегося мяса (на 1 кг мяса 1,5 л воды). Мясо без жира и сухожилий режут на кусочки размером 2,5 на 2,5 см. Варят мясо 15 мин, затем вынимают. Охлаждают и пропускают через мясорубку. Бульон, остывший до 50°С, подщелачивают Na₂Со₃ из расчета 3,0 г соды на 1 л. Добавляют поджелудочную железу из расчета 80,0-100,0 г на 1 кг мяса в зависимости от активности поджелудочной железы. Активность должна быть не менее 5 тыс. единиц по Фульд-Гроссу. Добавляют хлороформ 2% к общему объему содержимого реактора. Переваривание идет при 37°С. Первые сутки гидролизат перемешивают механической мешалкой, которую включают через каждые 2 ч на 5 мин. Ежедневно определяют аминный азот в гидролизате. С прекращением нарастания аминного азота, что бывает на 7-10 сутки, мешалку отключают, подогревание прекращают. Дают отстояться в течение 2 суток, затем жидкость отфильтровывают от осадка на пресс-фильтре, разливают по бутылям с добавлением 1% хлороформа, запробковывают и хранят при температуре 4-6°С.

Характеристика ферментативного гидролизата говяжьего мяса - рН 7,0; аминный азот 1100 мг%; аминный азот 878 мг%; процент расщепления 78,0%; натрия хлорида 0,087; пептон 1,2; кальций 4,2 мг%; магний 5,21 мг%; фосфор общий 6,5 мг%; фосфор неорганический 57,1 мг%; сухой остаток 10,0-1,5%; редуцирующие вещества 367 мг%.

Подготовка ферментативного гидролизата из говяжьего мяса (по МУК 4.1/2.588-96, с.45)

Ферментативный гидролизат из говяжьего мяса декантируют из баллона, затем фильтруют через ткань. Определяют количество аминного азота и по его содержанию рассчитывают количество гидролизата, необходимое для приготовления питательной среды. Если требуется осветление углем (темный гидролизат), то его берут на 10% больше, учитывая адсорбцию аминокислот при обработке углем. Если гидролизат после разведения по аминному азоту имеет соломенно-желтый цвет, то его не осветляют. Разводят очищенной водой в 2 раза, нагревают до кипения и добавляют 2% активированного угля марки ОУ-А (в расчете на разведенный гидролизат). Кипятят 15-20 мин при помешивании. Дают отстояться 20-30 мин и фильтруют сначала через вату, а затем через фильтровальное полотно.

Приготовление питательной среды жидкой для культивирования чумного микроба вакцинного штамма ЕВ.

Осветленный ферментативный гидролизат из говяжьего мяса разводят очищенной водой до содержания аминного азота (200±10) мг %. Кипятят. Добавляют натрий хлористый 4,0 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 4,0 г; натрий сернистокислый 4,0 г; устанавливают рН 7,1±0,1 - раствором соляной кислоты в соотношении 1:1 - 1,7 мл. Повторно кипятят, проверяют рН. Если рН не меняется, то среда готова. Жидкую питательную среду фильтруют через фильтровальное полотно и фильтровальную бумагу до полной прозрачности, затем добавляют стимулятор Карпузиди 0,008 г, разливают в стерильные бактериологические пробирки по (5±0,1) мл.

В качестве примера испытывали культуру чумного микроба вакцинного штамма ЕВ, выращенную на пластинках 2% агара Хоттингера рН 7,2 при температуре 27±1°С в течение 24 ч. Из суточной культуры готовили взвесь 1 млрд микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба ЕВ, равную 10 ед по оптическому стандарту мутности (ОСО 42-28-85 П), эквивалентную 1,0·10⁹ м.к./ мл в стерильном 0,9 % растворе натрия хлорида. Серийными 10-кратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1,03·10⁶ живых микробных клеток. Из данного разведения взвеси культуры высевали по 0,1 мл в 5 мл жидкой питательной среды. Посевы инкубировали при 21±0,1°С. Учет результатов проводили через каждые 3 часа в течение 48 ч для определения количества микробных клеток.

Пример 1. Вакцинный штамм чумного микроба ЕВ выращивали на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат говяжьего мяса 170,0; натрий хлористый 3,0; натрий сернистокислый 3,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0; стимулятор Карпузиди 0,006; соляная кислота 1,6; очищенная вода до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов количество микробных клеток при температуре 21±1°С через 48 ч культивирования составило 81 млн.

Пример 2. Вакцинный штамм чумного микроба ЕВ выращивали на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат говяжьего мяса 180,0; натрий хлористый 4,0; натрий сернистокислый 4,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 4,0; стимулятор Карпузиди 0,008; соляная кислота 1,7; очищенная вода до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов количество микробных клеток при температуре 21±1°С через 48 ч культивирования составило 155 млн.

Пример 3. Вакцинный штамм чумного микроба ЕВ выращивали на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат говяжьего мяса 190,0; натрий хлористый 5,0; натрий сернистокислый 5,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 5,0; стимулятор Карпузиди 0,010; соляная кислота 1,8; очищенная вода до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов количество микробных клеток при температуре 21±1°С через 48 ч культивирования составило 75 млн.

Полученные в примерах результаты обобщены в таблице 1.

Таким образом, заявленная питательная среда жидкая для культивирования чумного микроба вакцинного штамма ЕВ (пример №2) - является оптимальной по количеству подобранных ингредиентов, что в совокупности позволяет получить достаточное количество микробных клеток при температуре 21±1°С через 48 ч культивирования.

Питательная среда содержит ферментативный гидролизат говяжьего мяса, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, натрий сернистокислый, стимулятор Карпузиди и очищенную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет получить качественную питательную среду для культивирования микробных клеток чумного микроба вакцинного штамма ЕВ в достаточном количестве при температуре 21±1°С за 48 ч. 1 табл.

Питательная среда жидкая для культивирования чумного микроба вакцинного штамма ЕВ, состоящая, г/л:
Ферментативный гидролизат   говяжьего мяса 170,0-190,0 Натрий хлористый 3,0-5,0 Натрий сернисто-кислый 3,0-5,0 Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 3,0-5,0 Стимулятор Карпузиди 0,006-0,010 Очищенная вода до 1 л