ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS FLAVUS LINK - ПРОДУЦЕНТ МИКОТОКСИНА КОЕВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1995 года по МПК C12N1/00 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/67 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма микромицета, который может быть использован для получения микотоксина коевой кислоты, необходимой как стандарт-свидетель при микотоксикологических исследованиях кормов, пищевых продуктов, культур микромицетов с целью диагностики и профилактики коетоксикоза сельскохозяйственных животных и птицы.

Известны следующие виды микромицетов, способные продуцировать коевую кислоту: Aspergillus clavatus, A. effusus, А. flavus, А. flavus-oryzae, A. fumigatus, A. nidulans, A. oryzae, A. paraciticus, A. tamarii, А. ustus, Penicillium сitrinum, P. purpоrogenum, Р. rubrum [1]
Однако эти культуры не имеют практического значения для получения микотоксина, так как не изучен их биосинтез, не установлена продуктивность.

При изучении закономерностей накопления коевой кислоты использовали штамм Aspergillus flavus путем культивирования на различных зерновых злаках [2]
Однако этот штамм не обладает высокой токсинообразующей активностью, при этом наблюдается низкий урожай коевой кислоты, 0,75-3,20 мг/кг, в зависимости от вида субстрата.

Цель изобретения получение нового штамма микромицета, обладающего повышенной продуктивностью микотоксина коевой кислоты.

Для достижения цели предлагается штамм гриба Aspergillus flavus Link, Н-252, депонирован в коллекции грибов ВНИИ антибиотиков Минмедпрома СССР под номером 325 А. Штамм выделен из корма для животных. Видовая принадлежность определена по классификации Билай В.И.

Полученный штамм Aspergillus flavus Link, Н-252 имеет следующие морфологическую и физиологическую характеристики.

На агаре Чапека колонии быстро растущие, на 10-е сутки достигают 6-7 cм в диаметре, не превышающие 3-4 cм, состоят из довольно бесцветного тонкого мицелия, погруженного в окраинной зоне колонии до 1 см, радиально-бороздчатые, обильно спороносящие. Конидиальные головки желтых оттенков, желтого цвета, быстро изменяющие окраску от ярких до желто-зеленых оттенков: оливково-желтовато-зеленых до желтовато-тускло-зеленых при старении. Конидиальные головки радикальные, расщепляются на несколько плохо выраженных колонок, не превышают 400-500 мкм в диаметре. Конидиеносцы бесцветные, до 1 мм длиной, в терминальной части 10-20 мкм шириной и чуть шире к основанию, с утолщенной, грубошероховатой оболочкой. Апикальное расширение при формировании продолговатое, позже более или менее шаровидное, 25-45 мкм в диаметре. Стеригмы двухъярусные, постоянно образуются на конидиеносцах из более мелких головок, 6,5-14 х 5,5 мкм с утолщенной верхушкой. Конидии почти шароводные, шиповатые, варьируют от 3-6 мкм в диаметре. Штамм образует склероции темно-красно-коричневые. Реверзум бесцветный при отсутствии склероций.

Оптимальная температура роста штамма 30^оС, растет и при более низких температурах до 2^оС. Не растет при 52^оС. Оптимальная температура токсинообразования 26-30^оС.

На жидких питательных средах Чапека, Чапека-Докса, Ролана-Тома, Уилкинсона коетоксигенный штамм гриба хорошо растет и продуцирует микотоксин, также происходит накопление коевой кислоты и на естественных зерновых субстратах пшенице, ржи, овсе, кукурузе, ячмене и рисе.

Полученный штамм хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, мальтозу и рафинозу, плохо сорбит, манит и дульцит.

П р и м е р. Гриб-продуцент коевой кислоты Aspergillus flavus Link, штамм Н-252 выращивают на скошенном агаре Чапека в бактериологических пробирках при 30^оС в течение 5-6 cут, затем за сутки до планируемой даты заражения грибом-продуцентом среды Чапека-Докса с повышенным содержанием глюкозы стерилизуют 40 мин текучим паром. После стерилизации проводят заражение питательной среды конидиями гриба-продуцента (из расчета одна пробирка культуры на шесть-восемь) матрацев с питательной средой). Матрицы с культурой гриба на жидкой питательной среде инкубируют в термостате при 30^оС в течение 10-12 сут. После инкубирования гриба-продуцента культуральную жидкость отделяют от мицелия путем фильтрации через бумажный фильтр. Один литр культуральной жидкости выпаривают на ротационном испарителе под вакуумом при температуре не выше 50^оС до получения объема 200-300 cм³ и помещают в холодильник на 2-3 дн при температуре 0^оС. По мере охлаждения культуральной жидкости происходит осаждение микотоксина. Полученный осадок отфильтровывают и высушивают под частым вакуумом и проводят перекристаллизацию полученного препарата. Полученные кристаллы высушивают вначале под вакуумом, а затем в эксикаторе над безводным хлористым кальцием. Из одного литра культуральной жидкости получается свыше 30 г коевой кислоты.

Использование: в микробиологической промышленности для получения микотоксина коевой кислоты. Сущность применения: штамм, обладающий высокой продуктивностью микротоксина коевой кислоты, выделен из корма для животных. Штамм на жидкой среде Чапека-Докса с повышенным содержанием глюкозы на 10 12-е сутки культивирования при 30°С продуцирует максимальное количество коевой кислоты: 30 г/л питательной среды и имеет высокую стабильности токсинообразования.

Штамм гриба Aspergillus flavus Link ВНИИА 335 А продуцент микотоксина коевой кислоты.