Штамм бактерий Paenibacillus species - продуцент β-глюканазы Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 C12N9/34 C12R1/01 

Описание патента на изобретение RU2673967C1

Изобретение относится к отрасли микробиологической промышленности, в частности к производству ферментов, и касается нового штамма бактерий, используемого для получения фермента β-глюканазы.

β-глюкан - основной компонент клеточной стенки эндосперма зерновых и представляет собой сложный комплекс плохо усвояемых не крахмальных полисахаридов, который не расщепляется ферментами высших животных и птицы, но легко расщепляются микроорганизмами.

β-глюканазы являются гликолитическими ферментами, расщепляющими некрахмальные полисахариды и воздействующими на 3-4-β-гликозидные связи.

β-глюканазы представляют значительный интерес как компонент кормовых ферментных препаратов, а также для получения глюкозы из природного сырья, содержащего β-глюканы, для разрушения клеточных стенок растений и микроорганизмов с целью более полной экстракции полезных веществ и для утилизации отходов микробиологических производств

Наиболее известны штаммы - продуценты β-глюканаз грибного происхождения.

Так, известен штамм мицелиального гриба Penicillium funiculosum BKM F-3668D (RU 2287570). Однако данный штамм, помимо β-глюканазы, продуцирует ряд других карбогираз, а именно целлюлазу, ксиланазу, пектиназу и маннаназу, что не позволяет использовать этот штамм при производстве моноферментного препарата.

Также известен штамм Trichoderma aureoviride Rifai (RU 2422507), продуцирующий 1,3-β-D-глюканазу. Однако активность фермента, продуцируемого этим штаммом, является очень низкой (13,5-16 ед/мг белка). Недостатком использования этого штамма является также большая продолжительность культивирования (168 часов).

Наиболее близким к заявляемому штамму по технической сущности и достигаемому результату является штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-5790 (Ru 2046141). Штамм продуцирует комплекс гидролитических ферментов, включающий β-глюканазу с активностью 55 ед/мл культуральной жидкости, а также β-глюкозидазу, β-1,4 маннаназу, ксиланазу, α-амилазу, глюкоамилазу. нейтральную, щелочную и кислую протеазу. Из-за большого количества ферментов, штамм В. subtilis ВКПМ В-5790 не может быть использован при производстве моноферментного препарата.

Технической задачей изобретения является расширение арсенала штаммов микроорганизмов продуцирующих β-глюканазу.

Поставленная задача достигается получением бактериального штамма Paenibacillus sp. Bg1 - продуцента фермента β-глюканазы способного продуцировать фермент β-глюканазу с активностью 70 ед/мл культуральной жидкости за 30 часов культивирования, а также использовать β-глюкан как единственный источник углерода.

Заявляемый штамм выделен из почвы лесной зоны Московской области и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (ВКПМ), под регистрационным номером ВКПМ В-13093.

Штамм Paenibacillus sp. Bg1 характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки

При росте на агаризованной LB среде (мас.%: дрожжевой экстракт - 0,5, триптон - 1, NaCl - 1, агар - 2, вода - остальное) в течение 20 часов при 30°С образует выпуклые прозрачные колонии диаметром 0,5 - 2 мм с неровными краями.

После культивирования в течение 48 часов при 30°С в жидкой среде LB следующего состава (в мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, триптон - 1, NaCl - 1, вода - остальное) штамм образует палочковидные клетки размером 4-5 мкм с эллипсовидной проспорой в раздутом спорангии. Клетки как одиночные, так и собранные в цепочки по 2-4 клетки.

Физиолого-биологические признаки

Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях

Штамм Paenibacillus sp. Bg1 способен использовать β-глюкан как единственный источник углерода и продуцировать фермент β-глюканазу с активностью 70 ед/мл культуральной жидкости за 30 часов культивирования.

Оптимальная температура роста - 28-30°С, оптимальный рН - 7.

Штамм хранят в 10% глицерине при - 70°С в кельвинаторе или парах жидкого азота без потери жизнеспособности в течение 10 лет.

В качестве молекулярно-генетической характеристики штамма Paenibacillus sp. Bg1 использованы результаты ПЦР-фингерпринта (Applied and Environmental Microbiology, Oct, 1999, 4351-4356), представленные на фиг. 1.

Фингерпринт проводили методом полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием неспецифических праймеров М13 (линия 2) и 1254 (линия 3).

Праймер М13 gagggtggcggttct

режим реакции:

1 цикл

95°С - 3 мии.

39 циклов

95°С - 30 сек.

45°С - 30 сек.

72°С - 2 мин.

1 цикл

72°С - 5 мин

Праймер 1254 ccgcagccaa

режим реакции:

1 цикл

95°С - 3 мин.

39 циклов

95°С - 30 сек.

48°С - 30 сек.

72°С - 1 мин.

1 цикл

72°С - 5 мин

Для контроля величины фрагментов ДНК при электрофорезе использовали молекулярный маркер 1kb DNA GeneRuler (Fermentas) (линия 1, размер фрагментов снизу вверх 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.).

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения.

Фиг. 1. Фингерпринт штамма Paenibacillus sp. Bg1

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1. Продукция β-глюканазы заявляемым штаммом

Для получения посевного материала (инокулята) культуру клеток заявляемого штамма выращивают в жидкой среде LB, следующего состава (в мас.%): дрожжевой экстракт - 0,5, триптон - 1, NaCl - 1, вода - остальное, в течение 20 ч при 30°С и 250 об/мин.

Количество посевного материала - 5% от объема среды.

Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 50 мл жидкой среды следующего состава (в мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, триптон - 1, NaCl - 1, β-глюкан - 0,5, вода - остальное,

Колбы инкубируют на качалке при 30°С и 200 об/мин, в течение 30 ч. Затем клетки отделяют методом центрифугирования.

Активность β-глюканазы в культуральной жидкости определяют по способности расщеплять β-глюкан. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 мин при температуре 42°С и рН 6,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих Сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П. Синицын, А.В. Гусаков, И.М. Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995, с. 144-156).

Активность β-глюканазы составляет 70 ед/мл культуральной жидкости.

Пример 2. Способность заявляемого штамма к использованию β-глюкана в качестве единственного источника углерода

Клетки штамма Paenibacillus sp. Bg1 инкубируют при 30°С на среде следующего состава (в мас.%): NaNO3 - 0,1, K2HPO4 - 0.1, MgSO4 - 0.05, KCl - 0.1, дрожжевой экстракт - 0,05, β-глюкан - 1, агар - 1.5, вода - остальное. Образование колоний наблюдают через 48 часов.

В используемой среде единственным источником углерода является β-глюкан. Дрожжевой экстракт в количестве 0,05% необходим как источник витаминов и аминокислот.

Таким образом, показано, что штамм Paenibacillus sp. Bg1 ВКПМ В-13093 на полной питательной среде способен продуцировать фермент β-глюканазу с активностью 70 ед/мл культуральной жидкости за 30 часов культивирования и может быть использован при производстве моноферментного препарата.

Важным является также то, что заявляемый штамм может использовать β-глюкан как единственный источник углерода на минимальной среде.

Похожие патенты RU2673967C1

название год авторы номер документа
Штамм бактерий Paenibacillus species - продуцент ксиланазы 2017
  • Калинина Анна Николаевна
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2673971C1
Штамм дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий ксиланазу из Paenibacillus brasilensis 2019
  • Калинина Анна Николаевна
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Федай Татьяна Дмитриевна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2728243C1
Штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы 2018
  • Калинина Анна Николаевна
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Агранович Аннета Михайловна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2701642C1
Рекомбинантный штамм дрожжей Komagataella kurtzmanii - продуцент бета-глюканазы из Paenibacillus jamilae 2019
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Калинина Анна Николаевна
  • Федоров Александр Сергеевич
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2730577C1
Трансформант дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий ксиланазу 2019
  • Калинина Анна Николаевна
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Агранович Аннета Михайловна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2714113C1
Штамм дрожжей Komagataella kurtzmanii, продуцирующий бета-глюканазу из Bacillus pumilus и бета-глюканазу из Paenibacillus jamilae 2019
  • Калинина Анна Николаевна
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Федай Татьяна Дмитриевна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2736441C1
Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы из Pyromyces finnis 2019
  • Калинина Анна Николаевна
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2725475C1
Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы 2018
  • Калинина Анна Николаевна
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Агранович Аннета Михайловна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2701308C1
Рекомбинантный штамм дрожжей Komagataella kurtzmanii - продуцент бета-глюканазы 2018
  • Козлов Дмитрий Георгиевич
  • Чеперегин Сергей Эдуардович
  • Малышева Анастасия Васильевна
  • Санникова Евгения Павловна
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Калинина Анна Николаевна
  • Агранович Аннета Михайловна
  • Федоров Александр Сергеевич
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2701640C1
Дрожжи Komagataella kurtzmanii - рекомбинантный продуцент бета-глюканазы 2019
  • Калинина Анна Николаевна
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2736440C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 673 967 C1

Реферат патента 2018 года Штамм бактерий Paenibacillus species - продуцент β-глюканазы

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Штамм бактерий Paenibacillus sp. Bg1, обладающий способностью использовать β-глюкан как единственный источник углерода и синтезировать β-ксиланазу, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-13093. Штамм бактерий Paenibacillus sp. ВКПМ В-13093 может быть использован при производстве моноферментного препарата. Изобретение позволяет повысить активность β-глюканазы. 1 ил., 2 пр.

Формула изобретения RU 2 673 967 C1

Штамм бактерий Paenibacillus sp. ВКПМ В-13093 - продуцент β-глюканазы.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2018 года RU2673967C1

YE HUI- MIN, ZHANG DIAN - PENG et
al., Purification and characteristics analysis of the antifungal protein produced by Paenibacillus sp
Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Видоизменение прибора с двумя приемами для рассматривания проекционные увеличенных и удаленных от зрителя стереограмм 1919
  • Кауфман А.К.
SU28A1
Солесос 1922
  • Макаров Ю.А.
SU29A1
БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ TALAROMYCES EMERSONII 2001
  • Ван Ден Хомберг Йоханнес Петрус Теодорус Вильхельмус
  • Ван Дер Лан Ян-Метске
  • Дарен Жан-Марк Жорж
  • Хервейер Маргарета Адриана
  • Тойфель Даниэль Пауль
RU2321635C2
ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА PENICILLIUM FUNICULOSUM - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ, СОДЕРЖАЩЕГО ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ, КСИЛАНАЗЫ, ПЕКТИНАЗЫ И МАННАНАЗЫ 2002
  • Окунев Олег Николаевич
  • Синицын Аркадий Пантелеймонович
  • Черноглазов Владимир Михайлович
  • Соловьева Ирина Владимировна
RU2287570C2
ШТАММ ГРИБА Trichoderma aureoviride Rifai - ПРОДУЦЕНТ 1,3-β-D-ГЛЮКАНАЗ 2010
  • Пивкин Михаил Викторович
  • Бурцева Юлия Валериевна
  • Сова Виктория Васильевна
  • Звягинцева Татьяна Николаевна
RU2422507C1

RU 2 673 967 C1

Авторы

Калинина Анна Николаевна

Борщевская Лариса Николаевна

Гордеева Татьяна Леонидовна

Синеокий Сергей Павлович

Даты

2018-12-03Публикация

2017-12-19Подача