АДДУКТЫ ОРОТОВОЙ КИСЛОТЫ С АМИНОКИСЛОТАМИ ИЛИ АМИНАМИ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ГЕПАТОЗАЩИТНЫЙ ЭФФЕКТ Российский патент 1995 года по МПК C07D239/557 C07D307/66 A61K31/505 A61K31/34 

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям, в частности к производным оротовой кислоты, и может быть использовано в медицине, химии и в сельском хозяйстве.

Известно использование в медицине для защиты печени от интоксикаций, профилактики и лечения гепатита препаратов эссенциале (ФРГ), легалон (СФРЮ), лив-52 (Индия), оротат калия (СНГ) [1] и ряда симптоматических средств.

Арсенал лекарственных средств гепатопротекторного действия очень ограничен. Так перечисленные средства часто мало эффективны, обладают побочными действиями и в основном зарубежного производства. Установлено, что эссенциале усиливает жировую дистрофию печени, недостаточно эффективен и в настоящее время он закупается только странами СНГ. Основным показанием для клинического применения калия оротата является стимулирование анаболических процессов и белкового обмена, например, при дистрофии миокарда, элиментарной дистрофии у детей, прогрессирующей мышечной дистрофии. В меньшей степени препарат используется при хронических гепатитах и циррозе печени. В связи с перечисленным, калия оротат не нашел широкого применения в гастроэнтерологии [2] а чаще используется в качестве стимулятора анаболических процессов.

По химической структуре и по биологическому эффекту наиболее близким к заявляемым соединениям аналогом можно считать калия оротат, который выбран нами за прототип [1] и служил эталоном (препаратом сравнения) при экспериментальном изучении гепатозащитного действия заявляемых соединений (наряду с эссенциале и силибором).

Целью изобретения является создание новых потенциальных гепатопротекторов, близких к метаболитам организма, и их аналогам, обладающим высоким гепатозащитным эффектом.

Указанная цель достигается синтезом новых аддуктов оротовой кислоты с аминокислотами или аминами общей формулы:
где
R , CH₂CHOH, NH₂, NO₂
X-CH-(CH₂)_n-Z;
X=H, COOH, COOAlk;
Z=H, COOH, NH₂, CONH₂;
n=0-5.

Указанные химические соединения можно условно разбить на 4 отдельные группы:
оротаты моноамино- монокарбоновых кислот и их эфиров (соединения под лабораторным шифром ЛОС-3-88, ЛОС-8-88, ЛОС-11-89);
оротаты моноамино- дикарбоновых кислот или их амидов (соединения ЛОС-2-88, ЛОС-4-88, ЛОС-6-88, ЛОС-13-89);
оротаты диамино- монокарбоновых кислот (соединение ЛОС-5-88);
аддукты оротовой кислоты с аминами (соединения ЛОС-10-87, ЛОС-9-88, ЛОС-1-88, ЛОС-15-88).

Заявляемые соединения синтезированы впервые, в литературе они не описаны. Синтез их осуществлялся двумя основными способами: взаимодействием оротовой кислоты с аминокислотой или амином в водной среде (либо в отдельных случаях в органических растворителях) при комнатной температуре или при нагревании либо путем проведения обменной реакции между предварительно приготовленной, но невыделяемой из водного раствора в чистом виде водорастворимой триэтиламинной соли оротовой кислоты и хлоргидратом соответствующей аминокислоты или амина, полу-ченным, в свою очередь, из эквимолярных количеств соляной кислоты и соответствующего амина. Приготовленные такими способами соединения являются аддуктами состава 1:1, строение и состав которых подтверждены данными элементарного анализа, ИК- и ПМР-спектроскопии.

Оценку гепатозащитной активности исследуемых соединений проводили на моделях острого и хронического токсического активного гепатита у мышей и крыс в диапазоне доз 5-50 мг/кг при внутрибрюшинном введении испытуемых образцов и препаратов сравнения.

Использовались следующие методы и получены следующие результаты исследований гепатозащитного эффекта заявляемых соединений.

1. Оценка гепатозащитной активности на модели острого токсического гепатита у мышей. Испытания химических соединений проводили на беспородных мышах-самцах массой 20-22 г на модели острого токсического гепатита, который вызывали однократным внутрибрюшинным введением четыреххлористого углерода (ССl₄) в дозе 1,5 ДЛ₅₀ в виде 50%-ного раствора на вазелиновом масле.

Испытуемые химические соединения вводили однократно внутрибрюшинно за 1 ч до введения ССl₄ в дозе 50 мг/кг.

В качестве препаратов сравнения использовали отечественный гепатопротектор силибор и эссенциале (Германия, "Наттерманн"). Испытуемые химические соединения и препараты сравнения вводили в крахмальной слизи.

Гепатозащитный эффект оценивали по выживаемости мышей в течение 3-4 сут. Степень гепатозащитного эффекта выражали в процентах и определяли отношением числа выживших к общему числу использованных животных.

2. Оценка гепатозащитной активности на модели хронического токсического активного гепатита у крыс.

Исследования проводили на беспородных крысах-самцах массой 180-200 г. Гепатозащитное действие испытуемых химических соединений оценивали на модели хронического токсического активного гепатита (ХТАГ). Для моделирования ХТАГ животным внутрибрюшинно вводили ежедневно в течение 4 дней ССl₄ в дозе 0,2 мл 40%-ного раствора на вазелиновом масле на 100 г массы тела животного. Испытуемые химические соединения вводили в зависимости от МПД (5-25 мг/кг) внутрибрюшинно ежедневно за час до введения гепатотоксина в течение 6 дней. Забой животных осуществляли через 24 ч после последнего введения испытуемого химического соединения. После забоя животных извлекали печень и проводили гистологическую обработку материала стандартными методами с окраской гематоксилин-эозином. На гистологических препаратах оценивали в баллах (от 0 до 2) степень альтерации ткани печени. Основное внимание обращали на степень жировой и белковой дистрофии гепатоцитов, состояние микроциркулярного русла печени, активность воспалительного процесса паренхимы.

Препаратами сравнения служили эссенциале, калия оротат и силибор, которые вводили по указанной выше схеме.

1. Оценка гепатозащитного эффекта на модели острого токсического гепатита у мышей.

В результате проведенных первичных испытаний новых производных оротовой кислоты было выявлено, что почти все (11 из 12) испытанные соединения по сравнению с препаратами-стандартами (эссенциале, силибор) повышали выживаемость мышей при отравлении ССl₄ (см.таблицу). Наибольшая степень выживаемости (70-80% ) была при использовании соединений ЛОС-15-88 и ЛОС-9-88). Несколько ниже был эффект у соединений ЛОС-11-88, ЛОС-10-87 и ЛОС-1-88. Однако и в этом случае гепатозащитная активность в 2 раза превосходила препараты сравнения эссенциале и силибор, применяемые в клинической практике.

2. Оценка гепатозащитной активности на модели хронического токсического активного гепатита у крыс.

Изучение гепатозащитной активности химических соединений проводили на модели хронического токсического активного гепатита у крыс, вызываемого курсовым введением четыреххлористого углерода.

На 8-е сутки забоя у нелеченных животных после гистологического изучения паренхимы печени в ткани печени наблюдались выраженные признаки токсического поражения: центролобулярная резко выраженная вакуольнокапельная жировая дистрофия, занимающая большую часть дольки, белковая дистрофия, потеря белочной структуры, кариолизис отдельных гепатоцитов, в портальных полях крупно- и мелкоочаговые воспалительные инфильтраты, состоящие из лимфоцитов, расширение центральных вен и синусоидов. Морфометрический показатель поражения печени (ИП_п) был равен 1,03 ± 0,22.

У группы животных, получавших препарат сравнения эссенциале или силибор (25 мг/кг), состояние паренхимы визуально было несколько сохраннее. Однако во всех случаях на препаратах были видны отдельные клетки или группы клеток с вакуольнокапельной дистрофией, расширение центральных вен и синусоидов, диффузная дистрофия, кариолизис отдельных клеток печени. Морфометрический показатель поражения печени был равен для эссенциале 0,97 ± 0,27 и 1,03 ± 0,14 для силибора.

Таким образом, гепатозащитный эффект препаратов сравнения, применяемых в настоящее время в клинике, был мало заметным или практически отсутствовал.

Как видно из таблицы, ряд производных оротовой кислоты значительно превышал по гепатозащитной активности препараты сравнения. Так, химические соединения под шифрами ЛОС-3-88 и ЛОС-2-88 оказывали 100%-ный защитный эффект. Индекс поражения печени при использовании этих соединений был равен 0. На гистологических препаратах печени практически отсутствовали признаки жировой дистрофии и некроза гепатоцитов как в центре, так и на периферии дольки. Не наблюдалось воспалительного процесса, синусоиды, портальные поля и центральные вены были в норме.

Высокая гепатозащитная активность, равная 70% была выявлена у соединения ЛОС-5-88 и 50% у ЛОС-1-88, ЛОС-15-88. В этом случае сохранялась мелкокапельная центролобулярная жировая дистрофия отдельных гепатоцитов, примыкающих к центральной вене и занимающих не более 1/5-1/6 печеночной дольки. В портальных полях встречались клетки РЭС, окружая воротную вену, артериолу и желчный капилляр. Синусоиды были в норме. Среди гепатоцитов встречались клетки с фигурами митоза, что свидетельствовало об интенсивном регенеративном процессе в паренхиме, т.к. в норме в ткани печени митозы чрезвычайно редки и составляют 0,02%
Слабее гепатозащитный эффект (30%) наблюдался при использовании соединения ЛОС-10-87. При этом мелкокапельная дистрофия занимала 1/4 дольки. Среди гепатоцитов и в синусоидах встречались клетки РЭС. Больше их было в портальных полях. Однако отсутствовала крупнокапельная жировая дистрофия, некрозы, отек паренхимы, диффузия и портальная инфильтрация.

Следует отметить, что в аддуктах оротовой кислоты с аминокислотами при переходе от аминокислоты с длиной алкильной цепи, состоящей из двух метиленовых групп (ЛОС-3-88), к аддукту с аминокислотой, содержащей 6 метиленовых групп (ЛОС-8-88) гепатозащитный эффект полностью исчезает. Такая же закономерность проявляется при замене одной карбоксильной группы в оротате глутаминовой кислоты (ЛОС-2-88) на карбоксамидную группировку (ЛОС-6-88).

Таким образом, в результате проведенных испытаний новых аддуктов оротовой кислоты на моделях острого и хронического токсического гепатита, вызванного четыреххлористым углеродом, выявлено наличие высокой гепатозащитной активности у химических соединений ЛОС-3-88, ЛОС-2-88 и ЛОС-5-88, в несколько раз превышающей препараты сравнения эссенциале, калия оротат и силибор. Учитывая низкую токсичность изученных соединений и сходство по структуре с эндогенными веществами, можно заключить, что указанные соединения представляют собой перспективные новые химические соединения, на базе которых могут быть созданы оригинальные эффективные лекарственные препараты.

П р и м е р 1. Получение аддукта оротовой кислоты и β-аланина. К суспензии 15,6 г (0,1 г/мол) оротовой кислоты в 200 мл дистиллированной воды, нагретой до 80^оС, прибавляют при интенсивном перемешивании небольшими порциями 9,8 г (0,11 г/мол) β-аланина. Реакционную массу перемешивают до полного растворения осадка, затем постепенно охлаждают до 2-10^оС и кристаллизуют при этой температуре в течение 12-15 ч. Выпавший кристаллический продукт отфильтровывают под вакуумом, промывают водой и сушат при 105^оС до постоянной массы.

Получают 16,68 г целевого продукта (ЛОС-3-88) с выходом 69% от теории, разлагающегося при температуре выше 300^оС до его плавления.

Найдено, C 39,10; H 4,45; N 16,53.

C₇H₁₁N₃O₆.

Вычислено, C 39,20; H 4,48; N 17,00.

ИК-спектр в вазелиновом масле или в гексахлорбутадиене, (в см-1): 3165, 1680, 765.

ПМР-спектр в d⁶-ДМСО (в м. д. по шкале δ): 11,13c. 6,5-8,0c. 5,37c. 2,97т. 2,59т.

П р и м е р 2. Получение аддукта оротовой кислоты и L-глатаминовой кислоты.

К раствору 12,52 г (0,803 г/мол) оротовой кислоты в 50 мл воды с 10,6 мл триэтил-амина при 70-75^оС постепенно прибавляют раствор 11,8 г (0,803 г/мол) L-глутаминовой кислоты в 97 мл 3%-ной соляной кислоты, нагретых до 70^оС. Затем реакционную смесь охлаждают при перемешивании до 2-7^оС и выдерживают при этой температуре 2 ч, кристаллический продукт отфильтровывают, несколько раз промывают водой от хлоргидрата триэтиламина и сушат при температуре 105^оС в течение 8-10 ч.

Получают 20,1 г оротата глутаминовой кислоты (ЛОС-2-88) с выходом 85% от теории, разлагающегося при 225-230^оС без плавления.

Найдено, C 39,83; H 4,45; N 13,89.

C₁₀H₁₃N₃O₈.

Вычислено, C 39,62; H 4,32; N 13,87.

ИК-спектр (см^-1): 3085, 1690, 1640.

ПМР-спектр (в м.д.): 11,13с. 5,86с. 3,83т. 2,33т. 1,97м.

П р и м е р 3. Получение аддукта оротовой кислоты и аспарагиновой кислоты.

К раствору 10,87 г (0,815 г/мол) L-аспарагиновой кислоты в смеси 210 мл воды, 90 мл метилового спирта и 6,8 мл концентрированной соляной кислоты, нагретому до температуры 80^оС, прибавляют раствор 12,7 г (0,815 г/мол) оротовой кислоты в 75 мл воды и 11,4 мл триэтиламина, нагретый до температуры 80^оС. Затем реакционную массу перемешивают 2 ч при самоохлаждении, охлаждают до 5-8^оС и кристаллизуют в течение 16-18 ч. Кристаллический продукт отфильтровывают, промывают холодной водой, сушат на воздухе, а затем при температуре 110^оС в течение 8-10 ч.

Получают 17,78 г оротата L-аспарагиновой кислоты (ЛОС-4-88), разлагающегося при температуре 270^оС без плавления. Выход 75,8% от теории.

Найдено, C 37,67; H 3,95; N 14,76.

C₉H₁₁N₃O₈.

Вычислено, C 37,37; H 3,83; N 14,53.

ИК-спектр (см^-1): 3150-3080, 1700.

ПМР-спектр (м.д.): 11,17c. 5,90c. 4,03т. 2,73д.

П р и м е р 4. Получение диоротата лизина.

К раствору 5,11 г (0,033 г/мол) оротовой кислоты в 30 мл воды с 4,6 мл триэтиламина прибавляют при комнатной температуре раствор 2,99 г (0,0164 г/мол) моно-гидрохлорида D,L-лизина в 7 мл 9%-ного раствора соляной кислоты. Перемешивают 2 ч и затем кристаллизуют при температуре 5-8^оС в течение 16 ч. Продукт отфильтровывают, промывают водой и этиловым спиртом, сушат при 105^оС.

Получают 4,07 г (54,3% от теории) диоротата D,L-лизина (ЛОС-5-88), разлагающегося при температуре 235^оС.

Найдено, C 41,70; H 4,88; N 17,88.

C₁₆H₂₂N₆O₁₀.

Вычислено, C 41,90; H 4,83; N 18,34.

ИК-спектр (см^-1): 3130-3085, 1715-1660, 765, 750.

П р и м е р 5. Получение аддукта оротовой кислоты и гуанидина.

К раствору 21,63 г (0,139 г/мол) оротовой кислоты в 140 мл воды прибавляют 19,4 мл триэтиламина, а затем постепенно при комнатной температуре прибавляют раствор 13,25 г (0,139 г/мол) гуанидина гидрохлорида в 10 мл воды и перемешивают 2 ч. Затем после кристаллизации при температуре 5-7^оС в течение 16 ч продукт отфильтровывают, промывают холодной водой и сушат при 105^оС в течение 8 часов.

Получают 22,25 г оротата гуанидина с т.пл. около 330^оС (с разложением). Выход 74,7% от теории.

Найдено, C 33,41; H 4,46; N 32,58.

C₆H₉N₅O₄.

Вычислено, C 33,53; H 4,22; N 32,55.

ИК-спектр (см^-1): 3380, 3140, 1660-1700, 770, 760.

ПМР-спектр (м.д.): 5,73c. 7,33c.

П р и м е р 6. Получение аддукта оротовой кислоты и фурфуриламина.

1,74 г (0,01 г/мол) моногидрата оротовой кислоты растворяют при нагревании при 60-70^оС в 100 мл диметилформамида, раствор фильтруют и к горячему раствору прибавляют 1 мл (0,61 г/мол) свежеперегнанного фурфуриламина. Выдерживают при перемешивании 1 ч и после самоохлаждения до комнатной температуры отфильтровывают и промывают эфиром.

Получают 1,36 г оротата фурфуриламина (ЛОС-10-87) кремового цвета с т. пл. 309-312^оС (без разложения). Выход 53,5% от теории.

Найдено, C 47,62; H 4,25; N 16,85.

C₁₀H₁₁N₃O₅.

Вычислено, C 47,73; H 4,38; N 16,60.

ИК-спектр (см^-1): 1390, 780.

Таким образом, в предлагаемом изобретении выявлены новые химические соединения под шифрами ЛОС-2-88, ЛОС-3-88 и ЛОС-5-88, которые обладают высокой биологический активностью, препятствуя развитию жировых гепатозов при токсическом поражении печени четыреххлористым углеродом и увеличивают выживаемость животных при отравлении гепатотоксином. На базе указанных соединений могут быть созданы новые эффективные лекарственные препараты.

Научно-техническая применимость изобретения заключается в возможности полу-чения доступными методами новых соединений с высоким гепатозащитным эффектом, превышающим известные в клинической практике препараты того же назначения.

По двум наиболее активным соединениям проведены углубленные фармакологические испытания и разрабатывается необходимая научно-техническая документация на препарат, которая будет представлена в Фармкомитет для получения разрешения на проведение клинических испытаний.

Использование: в медицине, химии и сельском хозяйстве. Сущность изобретения: предложены аддукты оротовой кислоты с аминокислотами или аминами ф-лы 1, проявляющие гепатозащитный эффект NH₂R -остатки Бета аланина, ω -аминоэнантовой кислоты, метилового эфира изолейцина, D глутаминовой кислоты, амида глутаминовой кислоты, аспарагина, l лизина, фурфуриламина, 2-(3,4-диоксифенил)этиламина, гуанидина, D-(-)-трео-n-нитрофенил-2-амино-пропандиола-1,3. Реагент 1: оротовая кислота. Реагент 2: бета аланин. Условия реакции: температура до 80°С перемешивание, охлаждение и кристаллизация. Выход 69% от теории. Структура ф-лы 1: 1 табл.

Аддукты оротовой кислоты с аминокислотами и лиаминами общей формулы




X CH (CH₂)_n Z
где X H, COOH, COOAIk, Z H, COOH, NH₂, CONH₂, n 0 5,
проявляющие гепатозащитный эффект.