ШТАММ БАКТЕРИЙ LEPTOSPIRA INTERROGANS, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕПТОСПИРОЗНЫХ ВАКЦИН Российский патент 1995 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для получения очищенных от кроличьего белка лептоспирозных вакцин с высокими иммуногенными свойствами для людей.

Известен производственный штамм М-20, используемый при получении коммерческой лептоспирозной вакцины для людей.

Недостатками указанного штамма является то, что он не обладает стабильной вирулентностью и плохо растет на полусинтетических средах с белками сыворотки крови человека. Штамм культивируется на стандартной среде Терских с кроличьей сывороткой. В связи с этим при приготовлении лептоспирозной вакцины в ней присутствует значительное количество животного белка при относительно низком содержании собственно лептоспирозного антигена. Это обусловливает невысокую иммуногенность вакцины при наличии реального риска сенсибилизации иммунизируемых людей и нежелательных побочных явлений.

Для устранения указанных недостатков получен новый штамм Leptospira interrogans "Крыса 2", выделенный из почек серой крысы (Rattus norvegicus Berk), способный активно размножаться на полусинтетической среде с белками сыворотки человека, обладающий стабильной вирулентностью и высокой иммуногенностью и служащий для получения очищенных лептоспирозных вакцин с высокими иммуногенными свойствами и для контроля качества выпускаемых препаратов.

Штамм Leptospira interrogans "Крыса 2" хранят в коллекции музейных культур патогенных лептоспир в референс лаборатории ВОЗ при НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи под N 466 и используют в качестве контрольного штамма при оценке иммуногенности лептоспирозных вакцин в лаборатории ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Штамм адоптирован к новой полусинтетической среде, состоящей из набора аминокислот, витаминов, ростовых веществ, стабилизаторов и белков сыворотки человека "Протеин" и используют в Ростовском НИИМП для приготовления очищенной концентрированной инактивированной вакцины против иктерогеморрагического лептоспироза.

При серологической идентификации штамма Leptospira interrogans "Крыса 2" определена его принадлежность к лептоспирам серологической группы Icterohae- morrhagiаe серовара copenhagen. Штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки. Типичные хорошо подвижные спиралеподобные нити длиной 7-10 мкм и диаметром 0,06-0,10 мкм. Концы лептоспир загнуты в виде крючков.

Культуральные признаки. Культивирование штамма осуществляют на жидких питательных средах: стандартной среде Терских с 5%-ной кроличьей сывороткой и полусинтетической среде с белками сыворотки человека, разработанной в Ростовском НИИМП. Оптимальный рост лептоспир наблюдают при рН 7,2-7,4 и температуре 28 30^оС, достигая максимума на 7-10 сут. культивирования (от 50 до 200 особей в темном поле микроскопа с увеличением в 200 раз). По сравнению со средой Терских полусинтетическая среда, на которой известный производственный штамм М-20 плохо растет, обеспечивает более высокий рост штамма "Крыса 2" в течение длительного времени без пересевов (3 месяца срок наблюдения). При размножении штамма лептоспир на указанных выше питательных средах их внешний вид не изменяется. Среда остается прозрачной или слегка опалесцирующей в течение всего периода наблюдения. Сравнительные данные роста штамма L. interrogans "Крыса 2" и штамма М-20 на средах различного состава представлены в таблице.

Штамм L.interrogans "Крыса 2" хранят в соответствии с инструкцией хранения патогенных микробов при комнатной температуре и пересевают не реже одного раза в месяц при культивировании на среде Терских и через 2-3 месяца на полусинтетической среде. Для длительного хранения штамм замораживают в жидком азоте.

Физиологические свойства. Лептоспиры относятся к хемоорганотрофам. Они ассимилируют углерод из органических соединений белковой и липидной природы.

Устойчивость. При кипячении, высушивании и под воздействием дезинфицирующих растворов лептоспиры погибают почти моментально. При нагревании до 56 58^оС они гибнут в течение 25 30 мин. К низким температурам лептоспиры весьма устойчивы, оставаясь жизнеспособными после длительного замораживания в жидком азоте (4 года срок наблюдения). Штамм лептоспир чувствителен к пенициллину, тетрациклину и стрептомицину.

Фильтруемость. Лептоспиры способны проходить через мембранные фильтры со средним диаметром пор 0,22 мкм.

Вирулентность. Изучение вирулентности штамма проводят по общепринятой методике на морских свинках, кроликах сосунках и золотистых хомяках. Определенная LD₅₀ для золотистых хомяков составляет 2 ˙ 10⁴ микробных тел. У зараженных хомяков, кроликов и морских свинок заболевание в первые дни протекает с явлениями повышения температуры и падением веса. На 5-12 день после инфицирования у животных появляется желтушная окраска склер, видимых слизистых оболочек и кожи. Через 12 48 ч после появления желтухи животное погибает. На вскрытии обнаруживается увеличение почек и геморрагии во внутренних органах, коже и подкожной клетчатке. Особенно типичны крупноточечные кровоизлияния в легочной ткани.

Иммуногенность. Двухкратная с интервалом в 10 дней внутривенная иммунизация кроликов штаммом L. interrogans "Крыса 2" в дозе 1 мл, с содержанием 100-150 особей лептоспир в темном поле микроскопа (х 200), вызывает образование антител в РМА в титрах более 1 50 тысяч. Иммунная сыворотка в дозе 1 мл защищает 100% золотистых хомяков от их заражения при введении вирулентной культуры лептоспир серогруппы Icterohaemorrhagiаe.

П р и м е р 1. Получение вакцины. 7 10-дневную культуру штамма Leptospira interrogans "Крыса 2" (100 150 лептоспир в поле зрения микроскопа х 200), выращенную на среде Терских с 5%-ной кроличьей сывороткой, пересевают в биологические пробирки с накопительной полусинтетической средой с человеческим протеином (3 мл культуры на 1 пробирку). Посевы инкубируют в термостате при 28-30^оС в течение 7 10 дней. Полученную маточную культуру высевают во флаконы (300 мл) с полусинтетической средой с человеческим протеином (1 пробирка культуры на 1 флакон. Через 7 10 дней роста в термостате при 28 30^оС выращенную микробную массу иммобилизируют путем добавления в нее формальдегида до (0,35 ± 0,05)% концентрации в среде и выдерживают 10 мин при комнатной температуре.

Иммобилизированную и предварительно инактивированную микробную массу центрифугируют на рефрежираторной центрифуге при 6^оС и 6000 об/мин в течение 40 мин. Полученную концентрированную биомассу лептоспир двухкратно обмывают 1/15 М фосфатным буфером (рН 7,3-7,4) при центрифугировании 6000 об/мин (40 ± 10) мин и температуре камеры 5^оС. В отмытой биомассе определяют концентрацию лептоспир в 0,9%-ном растворе хлористого натрия. Затем биомассу лептоспир разводят физраствором до 1 млрд. микробных тел по оптическому кишечному стандарту мутности и добавляют в нее формальдегид до его концентрации 0,02-0,03% Концентрированную и стандартизованную биомассу лептоспир инактивируют теплом (56 57^оС) в течение 30 35 мин и выдерживают при комнатной температуре 1 сут. после чего проводят повторную инактивацию вакцины при 56 57^оС в течение 30 35 мин.

Штамм Leptospira interrogans "Крыса 2" имеет как научное, так и практическое значение. Он используется при контроле оценки иммуногенности выпускаемых лептоспирозных вакцин в тесте активной защиты и при получении новых вакцин для людей с высокими антигенными и иммуногенными свойствами.

Использование: медицинская микробиология, контроль иммуногенности вакцин. Сущность изобретения: для получения лептоспирозных вакцин без кроличьего белка предлагается новый штамм Leptospirra interrogans "Крыса 2" НИИЭМ N 466, способный активно размножаться на полусинтетической среде с человеческим протеином и обладающий стабильной вирулентностью и высокой иммуногенностью. Штамм лептоспир позволяет получать очищенные от животного белка лептоспирозные вакцины с высокими антигенными и протективными свойствами для иммунизации людей против интерогеморрагического лептоспироза. 1 табл.

Штамм бактерий Leptospira interrogans НИИЭМ N 466, предназначенный для получения лептоспирозных вакцин