Вирулентный штамм бактерий Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae серовара copenhageni, используемый для экспериментального изучения лептоспирозной инфекции Российский патент 2022 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя лептоспироза, обладающий выраженной вирулентностью и используемый для экспериментального изучения лептоспирозной инфекции.

У людей это заболевание может иметь различные клинические проявления, начиная от субклинической инфекции и заканчивая тяжелой прогрессирующей формой, которая может привести к летальному исходу (Ko AI, Goarant С, Picardeau Μ. Leptospira: the dawn of the molecular genetics era for an emerging zoonotic pathogen. Nature reviews // Microbiology. 2009; 7: 736-747. doi: 10.1038/nrmicro2208 [РМС free article] [PubMed]).

По оценкам ряда авторов в год в мире наблюдается более 1 миллиона тяжелых случаев лептоспироза и около 60000 смертей от этого заболевания (Federico Costa, José E. Hagan, Juan Calcagno, Michael Kane, Paul Torgerson, Martha S. Martinez-Silveira, Claudia Stein, Bernadette Abela-Ridder, and Albert I. Ko. Global Morbidity and Mortality of Leptospirosis: A Systematic Review // Travel Med Infect Dis. 2015 Sep-Oct;13(5):388-93. doi: 10.1016/j.tmaid.2015.08.006. Epub 2015 Aug 31.

В настоящее время известно, что заболевания, вызванные лептоспирами серогруппы Icterohaemorrhagiae протекают особенно тяжело с поражением различных органов и систем заболевших (Авдеева М.Г. Иктерогеморрагический лептоспироз: исходы и течение отдаленной реконвалесценции // Клиническая медицина. 2003. № 6. 42-47). Развитие полиорганной недостаточности приводит к частыми летальными исходами. По мнению ряда исследователей, несмотря на многолетнее изучение лептоспироза, некоторые звенья его патогенеза остаются недостаточно изученными равно, как и методы рационального лечения. В связи с этим необходимо продолжение исследований по изучению патогенеза лептоспирозной инфекции и отработке эффективных методов лечения. Решению этих задач могут помочь экспериментальные исследования на лабораторных животных. Для проведения этих исследований необходим вирулентный штамм лептоспир, вызывающий яркую клиническую картину лептоспирза.

Изобретение направлено на получение вирулентного штамма лептоспир серогруппы Icterohaemorrhagiae для экспериментального изучения лептоспирозной инфекции. Инфицирование экспериментальных животных предложенным штаммом позволит получить характерную для иктерогеморрагического лептоспироза клиническую картину с присущими ему патологическими изменениями.

Технический результат - развитие более выраженной клинической картины интерогеморагического лептоспироза с характерными патологическими изменениями у экспериментальных животных.

Штамм Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae серовара copenhageni № 352 «Таганрог 2018» выделен из органов умершего от лептоспирозной инфекции человека в 2018 году. Штамм депонирован, как вирулентный штамм лептоспир, в Российской коллекции эталонных штаммов патогенных и сапрофитных лептоспир Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени академика Н.Ф. Гамалеи под номером 523.

Морфологические и физиологические характеристики. Грамотрицательные спирохеты с характерной морфологией и подвижностью, спор и капсул не образуют. Относятся к хемоорганотрофам и гидрофилам, культивируются на жидкой питательной среде. Лаг-фаза длится двое суток, экспотенциальная фаза характеризуется продолжительностью в 7 суток, время генерации 24 ч. В стационарной фазе наибольшая концентрация составляет (5,3±0,3) × 10⁷ лептоспир в 1 мл. Культивируются на жидкой фосфатно-сывороточной среде Терских, состоящей из 90% дистиллированной воды, 10% фосфатного буфера (рН=7,2) с добавлением 10% сыворотки кролика. Оптимальная температура культивирования +28°С.

При изучении штамма использованы различные методы типирования изолята, включая реакцию микроскопической агглютинации (РМА), MALDI-TOF - масс-спектрометрию, генотипирование с использованием последовательности LipL32 и полногеномное секвенирование. Оба молекулярных метода установили, что штамм Taganrog-2018, принадлежит к L. Interrogans, серовару copenhageni в пределах серогруппы Icterohaemorrhagiae. Метод MALDI-TOF - масс-спектрометрии, также подтвердил принадлежность штамма к серовару copenhageni. Осуществлено полногеномное секвенирование штамма Leptospira spp.(Таганрог 2018). (GenBank-SJDW01000000, 18-JUN-2020). По сравнению со штаммом аналогом в настоящем изобретении предлагается «свежевыделенный» штамм L. Icterohaemorrhagiae. Известно, что «свежевыделенные» штаммы лептоспир обладают наиболее выраженной вирулентностью нежели штаммы, выделенные 10-30 лет тому назад» (Самохвалов А.П. Антигенные и иммуногенные свойства лептоспир в зависимости от сроков выделения // Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней, общих для человека и животных: материалы Всесоюз. конф. - Львов, 1988. - С. 211).

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Способ получения штамма

Штамм получен путем посева легких умершего от лептоспироза человека на жидкую питательную фосфатно-сывороточную среду Терских, состоящую из 90% дистиллированной воды, 10% фосфатного буфера (рН=7,2) с добавлением 5% сыворотки кролика. Культивирование штамма осуществлялось при температуре - 28°С в течение 10 суток, с последующим определением серологической принадлежности и генотипированием штамма, изучением его биологических свойств.

Пример 2. Способ применения штамма

Вирулентность предлагаемого штамма определяли путем расчета ЛД-50, используя метод Кербера (Красильников А.П. Микробиологический словарь-справочник Беларусь, 1986. - 351 с.) С этой целью использовали живую культуру L. Icterohaemorrhagiae, выращенную на среде Терских с добавлением сыворотки кролика, со сроком культивирования 7-14 суток. Культура должна иметь хорошую подвижность, накопление 10⁷ клеток на 1 мл, что соответствует 50-100 лептоспирам в поле зрения микроскопа при увеличении х400.

ЛД-50 определяли при внутрибрюшинном введении культуры лептоспир золотистым хомячкам массой 30,0 г. ЛД-50 предлагаемого штамма составляет

В скобках указан доверительный интервал значения ЛД-50 с вероятностью 95% Клинические проявления инфекции у экспериментальных животных характеризуются появлением лихорадки у 100% животных, геморрагий у 100% и желтухи у 80%. Таким образом, у животных развивается яркая картина иктерогеморрагического лептоспироза.

Изучение вирулентности прототипа. В качестве прототипа был выбран штамм лептоспир серогруппы Icterohaemorrhagiae - «Рябухин», который был выделен из крови умершего от лептоспироза человека в 1982 году. Изучение в эксперименте на золотистых хомячках вирулентности прототипа показало, что ЛД-50 равна

В скобках указан доверительный интервал значения ЛД-50 с вероятностью 95% Клинические проявления инфекции у экспериментальных животных при использовании прототипа характеризовались появлением лихорадки у 80% животных, геморрагий у 50% и желтухи у 70%.

Пример использования штаммов «Таганрог 2018» и «Рябухин» представлен в таблице 1.

Таким образом установлено, что предлагаемый штамм обладает более выраженной, по сравнению с прототипом, вирулентностью и может быть использован для экспериментального изучения интерогеморрагического лептоспироза.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae серовара copenhageni № 352 «Таганрог 2018» депонирован в Российской коллекции эталонных штаммов патогенных и сапрофитных лептоспир Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени академика Н.Ф. Гамалеи под регистрационным номером 523 и может быть использован как вирулентный штамм лептоспир. Изобретение позволит в опытах на экспериментальных животных воспроизвести клиническую картину иктерогеморрагического лептоспироза с характерными патологическими изменениями. 1 табл., 2 пр.

Штамм бактерий Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae серовара copenhageni, депонированный в Российской коллекции эталонных штаммов патогенных и сапрофитных лептоспир национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени академика Н.Ф. Гамалеи под номером 523, в качестве вирулентного штамма лептоспир, используемый для экспериментального изучения лептоспирозной инфекции.